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1、第7章 微生物的遗传 变异和育种,第三节 基因重组和杂交育种,一、原核生物的基因重组,转化,转导,接合,原生质体融合,自然条件下的基因重组,接合 (conjugation)：,细胞与细胞的直接接触（由F因子介导）,转导(transduction)：,由噬菌体介导,自然遗传转化(natural genetic transformation)：,游离DNA分子 + 感受态细胞,一、原核生物的基因重组,（一）细菌的遗传转化,定义：同源或异源的游离DNA分子(质粒和染色体DNA)被自然 或人工感受态细胞摄取，并得到表达的水平方向的基因转移过程,自然遗传转化（natural genetic transf
2、ormation）,人工转化（artificial transformation）,感受态细胞：具有摄取外源DNA能力的细胞,（competent cell）,一、原核生物的基因重组,自然感受态与人工感受态的不同？,自然感受态的出现是细胞一定生长阶段的生理特性， 受细菌自身的基因控制；,人工感受态则是通过人为诱导的方法，使细胞具有 摄取DNA的能力，或人为地将DNA导入细胞内。 （该过程与细菌自身的遗传控制无关！）,（一）细菌的遗传转化,1、自然遗传转化（简称自然转化）,1928年，Griffith发现肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae） 的转化现象,目前已知有二十多
3、个种的细菌具有自然转化的能力,进行自然转化，需要二方面必要的条件：,建立了感受态的受体细胞,外源游离DNA分子,枯草芽孢杆菌的自然转化过程（革兰氏阳性菌的转化模型）,细菌的转化模型,（一）细菌的遗传转化,外源DNA单链的整合,（一）细菌的遗传转化,自然转化过程的特点：,a）对核酸酶敏感；,c）转化是否成功及转化效率的高低主要取决于转化（DNA） 给体菌株和转化受体菌株之间的亲源关系；,d）通常情况下质粒的自然转化效率要低得多；,提高质粒的自然转化效率的二种方法： 1）使质粒形成多聚体，这样进入细胞后重新组合成有 活性的质粒的几率大大提高； 2）在质粒上插入受体菌染色体的部分片段，或将质粒转 化
4、进含有与该质粒具有同源区段的质粒的受体菌-重组获救,b）不需要活的DNA给体细胞；,噬菌体DNA被感受态细胞摄取并产生有活性的病毒颗粒,转染(transfection)：,现在把DNA转移至动物细胞的过程也称转染,提纯的噬菌体DNA以转化的（而非感染）途径进入细胞 并表达后产生完整的病毒颗粒。,特点：,自然遗传转化的进行涉及到细菌染色体上几十个 基因的功能及彼此间的相互协调，因此被认为是 名副其实 的细菌水平基因转移途径。,目前的研究热点：,1）细菌为什么要耗费如此多的染色体遗传资源来进行自然转化， 即该过程的生物学意义到底何在？它对细菌自身有什么好处？ （人们已提出了一些假说，但均不圆满）,
5、2）自然转化过程的很多细节仍不清楚，包括细菌如何协调感受态 的建立，外源DNA进入和重组的具体过程等等,3）细菌中具有自然转化能力的范围，到底有那些菌具有自然 转化能力？,4）转化DNA的来源和在自然环境中发生的自然转化,水环境和陆地环境中通过游离DNA进行的基因转移（转化）,（一）细菌的遗传转化,2、人工转化,用CaCl2处理细胞，电穿孔等是常用的人工转化手段。,在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段， 是基因工程的奠基石和基础技术。,不是由细菌自身的基因所控制；,用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一 种可以摄取外源DNA的“人工感受态”。,质粒的转化效率高；,（二）细
6、菌的转导（transduction）,由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式： 一个细胞的DNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中,能将一个细菌宿主的部分染色体或质粒DNA 带到另一个细菌的噬菌体称为转导噬菌体,细菌转导的二种类型：,普遍性转导,局限性转导,1、普遍性转导（generalized transduction）,噬菌体可以转导给体染色体的任何部分到受体细胞中的转导过程,(1) 意外的发现,1951年，Joshua Lederberg和Norton Zinder为了证实大肠杆菌以外 的其它菌种是否也存在接合作用，用二株具不同的多重营养缺陷型 的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验：
7、,用“U”型管进行同样的实验时，在给体和受体细胞 不接触的情况下，同样出现原养型细菌！,沙门氏菌LT22A是携带P22噬菌体的溶源性细菌 另一株是非溶源性细菌,一个表面看起来的常规研究却导致 一个惊奇和十分重要发现的重要例证！,基因的传递很可能是由可透过“U”型管滤板的 P22噬菌体介导的,（普遍性转导这一重要的基因转移途径的发现）,(2) 转导模型,转导噬菌体为什么“错” 将宿主的DNA包裹进去?,噬菌体的DNA包装酶酶也能识别染色体DNA上类似pac的位点 并进行切割，以“headful”的包装机制包装进P22噬菌体外壳， 形成只含宿主DNA的转导噬菌体颗粒（假噬菌体）。,因为染色体上的p
8、ac与P22 DNA的pac序列不完全相同， 利用效率较低，这种“错装”机率一般仅约10-6-10-8,形成转导颗粒的噬菌体可以是温和的也可以是烈性的，但必须具有能偶尔识别宿主DNA的包装机制并在宿主基因组完全降解以前进行包装。,普遍性转导的基本要求：,普遍性转导的三种后果：,进入受体的外源DNA通过与细胞染色体 的重组交换而形成稳定的转导子,流产转导（abortive transduction）,转导DNA不能进行重组和复制，但其 携带的基因可经过转录而得到表达。,特点：在选择培养基平板上形成微小菌落,外源DNA被降解，转导失败。,DNA不能复制，因此群体中仅一个细胞含有DNA， 而其它细胞
9、只能得到其基因产物，形成微小菌落。,2、局限性转导（specialized transduction）,温和噬菌体感染,整合到细菌染色体的特定位点上 宿主细胞发生溶源化,溶源菌因诱导而发生裂解时， 在前噬菌体二侧的少数宿主 基因因偶尔发生的不正常切 割而连在噬菌体DNA上,部分缺陷的温和噬菌体,把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中,2、局限性转导（specialized transduction）,温和噬菌体裂解时的 不正常切割：包含gal或bio基因 （几率一般仅有10-6）,缺陷噬菌体在宿主细胞内能够象正常的DNA分子一样进行复制、 包装，提供所需要的裂解功能，形成转导颗粒。 但没有正常噬
10、菌体的溶源性和增殖能力，感染受体细胞后，通过 DNA整合进宿主染色体而形成稳定的转导子。,局限性转导与普遍性转导的主要区别：,a）被转导的基因共价地与噬菌体DNA连接，与噬菌体DNA一起 进行复制、包装以及被导入受体细胞中。而普遍性转导包装的 可能全部是宿主菌的基因。,b）局限性转导颗粒携带特定的染色体片段并将固定的个别基因 导入受体，故称为局限性转导。而普遍性转导携带的宿主基 因具有随机性。,2、局限性转导（specialized transduction）,溶源转变（lysogenic conversion）：,一个与转导相似又不同的现象,温和噬菌体感染细胞后使之发生溶源化，因噬菌体的基因
11、 整合到宿主染色体上，而使后者获得了新性状的现象。,溶源转变与转导的不同？,a）不携带任何供体菌的基因；,b）这种噬菌体是完整的，而不是缺陷的；,(三)细菌的接合作用(conjugation),通过细胞与细胞的直接接触而产生的 遗传信息的转移和重组过程,1.实验证据,1946年，Joshua Lederberg 和Edward L.Taturm 细菌的多重营养缺陷型杂交实验,中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致！,证实接合过程需要细胞间的直接接触的 “U”型管实验（ Bernard Davis，1950 ）,2. 机制,(大肠杆菌的接合机制),接合作用是由一种被称为F
12、因子的质粒介导,F因子上面有编码细菌产生性菌毛（sex pili） 及控制接合过程进行的20多个基因。,含有F因子的细胞：“雄性”菌株（F+），其细胞表面有性菌毛,不含F因子的细胞：“雌性”菌株（F-），细胞表面没有性菌毛,F因子为附加体质粒 既可以脱离染色体在细胞内独立存在，也可插入（整合）到染色体上,F因子的四种细胞形式,a）F-菌株， 不含F因子，没有性菌毛，但可以通过 接合作用接收 F因子而变成雄性菌株（F+）；,b）F+菌株， F因子独立存在，细胞表面有性菌毛。,c）Hfr菌株，F因子插入到染色体DNA上，细胞表面有性菌毛。,d）F菌株，Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时
13、， 形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F因 子。 细胞表面同样有性菌毛。,1） F+F-杂交,杂交的结果：给体细胞和受体细胞均成为F+细胞,理化因子的处理可将F因子消除而使F+菌株变成F-菌株,F+菌株的F因子向F-细胞转移，但含F因子的宿主细胞 的染色体DNA一般不被转移。,Hfr菌株的F因子插入到染色体DNA上，因此只要发生接合转移 过程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给F-细胞并发生重组 ，由此而得名为高频重组菌株。,2）Hfr F-杂交,Hfr菌株仍然保持着F+细胞的特征，具有F性菌毛，并象F+一样与F- 细胞进行接合。所不同的是，当OriT序列被缺刻螺旋酶识别而产生
14、 缺口后，F因子的先导区(leading region)结合着染色体DNA向受体细 胞转移，F因子除先导区以外，其余绝大部分是处于转移染色体的末 端，由于转移过程常被中断，因此F因子不易转入受体细胞中，故 HfrF-杂交后的受体细胞(或接合子)大多数仍然是F-。,染色体上越靠近F因子的先导区的基因，进入的机会 就越多，在F-中出现重组子的的时间就越早，频率也高。,F因子不易转入受体细胞中，故HfrF- 杂交后的受体细胞（或称接合子）大多 数仍然是F-。,中断杂交实验,中断杂交实验结果分析及定位,大肠杆菌K12的遗传图谱,3）FF-杂交,Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时， 形成游离
15、的但携带一小段染色体基因的F因子， 特称为F因子。,FF-与F+F-的不同：给体的 部分染色体基因随F一起转入受体细胞,a）与染色体发生重组；,b）继续存在于F因子上， 形成一种部分二倍体；,细胞基因的这种转移过程又常称为性导（sexduction）、F因子转导 （F-duction），或F因子媒介的转导（F-mediated transduction）。,接合 (conjugation)：,细胞与细胞的直接接触（由F因子介导）,转导(transduction)：,由噬菌体介导,自然遗传转化,游离DNA分子 + 感受态细胞,“接合” “转导” 及“自然转化”这三种在自然界中 存在的细菌遗传重组
16、过程各自的特点：,a）外源DNA的来源及进入途径有差异；,b）决定因素也各有不同；,如何设计实验对三种途径进行区分？,原生质体融合：,通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。,技术路线：,亲本菌株A,亲本菌株B,脱壁,方法？,原生质体A、B,遗传标记,遗传标记,助融剂,等渗培养基，再生出菌落,选择培养基， 筛选目标菌,第五节 菌种的衰退、复壮和保藏,性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则 生产或科研都无法正常进行。,影响微生物菌种稳定性的因素：,a）变异；,b）污染；,c）死亡；,一、菌种的衰退与复壮,1）从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获得具有 原有典型性状的菌种。,2）有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种 维护工作中不断筛选“正变”个体。,大量群体中的自发突变,菌种的复壮：,a）纯种分离；,b）通过寄主体进行复壮；,菌种衰退的特点：,二、防止衰退的
