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1、非小细胞肺癌基因检测 肿瘤二科 刘丽珠,前言,随着分子医学进展和靶向药物的不断涌现，晚期非小细胞肺癌（NSCLC）的治疗已进入到个体化治疗的时代。 目前临床应用的个体化靶向治疗主要针对EGFR突变型和ALK融合基因型肺癌,这两种基因变异型肺癌均具有明确的分子靶点、靶点检测技术及上市的靶向药物，临床疗效得到明显提高。,EGFR突变检测中需要明确的几个基本概念,2、基因突变是指DNA发生碱基序列的改变：须选择有针对性的检测手段，针对非DNA的检测手段如：RT-PCR（检测RNA表达），免疫组化（检测蛋白表达）以及针对非碱基序列的检测手段如：FISH（检测DNA的扩增、缺失、断裂、融合）等，均不适用
2、。,1、EGFR突变为体细胞突变：发生于肿瘤细胞中，正常细胞（癌旁或白细胞等）不含突变。要尽可能取到足量的肿瘤细胞进行检测，这是保证检测结果可靠的根本前提。,EGFR基因突变检测概念,EGFR突变检测指肿瘤组织中编码EGFR基因的DNA突变状态检测 并不是： EGFR基因DNA拷贝数的检测（FISH法） EGFR蛋白表达量的检测（IHC法）。,X,Nature Review 2007, 7:169,NSCLC中EGFR酪氨酸激酶区突变种类,标本采集及病理评估,DNA 抽提及质控,检测报告,EGFR突变检测,ARMS,测序法,其它方法,EGFR 突变检测流程,EGFR突变检测中的相关角色,患者,
3、临床医生,胸外科医师,内镜医师,收集肺癌组织标本,病理科医生,准备样本,实验操作及结果分析,实验室人员,报告结果给临床医生,肿瘤科医生 放疗科医生 呼吸科医生,用于EGFR突变检测的标本,肿瘤组织目前最可靠的标本； 其它样本： 外周血（血浆、血清） 细胞学 （胸水、痰液细胞学） 支气管刮取物,仍需进一步研究确定这些样本在临床实践及诊断中的应用,标本问题,石蜡组织：尽可能送检一年内的石蜡标本。 石蜡切片：含肿瘤细胞越多越好（50%以上）；组织部位面积约6mm x 6mm以上； 包埋组织：组织块不小于0.50.50.5（cm）。 新鲜组织：比石蜡等处理过的旧组织，DNA保存得更完整，对PCR实验更
4、有利，但一定要经病理学确认。 含有肿瘤组织50%以上；重量10g（约米粒大小以上），经PBS或生理盐水冲洗干净。 取癌组织的中心位置组织块（避开坏死区域），固定于10%中性福尔马林溶液中，尽快送病理科。 细胞学标本：可用 原发灶与复发灶：只要能获得足够的癌细胞，均可；但对于复发的患者，再次活检不仅可确诊，还可以获得分子标志物的进一步信息。,标本因素对EGFR突变检测的影响 -肿瘤组织特点-,遗传异质性,对检测方法敏感度有较高要求,标本因素对EGFR突变检测的影响 -组织标本种类-,对检测方法有相应要求，组织标本及DNA质控尤其重要,图4. EGFR基因检测使用的临床样本及其操作。A.被切成10
5、微米的石蜡包埋标本。B.在支气管镜下将刷检样本放在生理盐水中洗净（悬浮），可以就这样冷冻保存，C.进一步将该生理盐水液离心，沉淀溶解于AL缓冲液，此状态可以室温保存。,肿瘤组织标本的采集及病理评估,肿瘤组织标本,病理学评估,组织切片,非小细胞性肺癌诊断及类型 肿瘤细胞比例 肿瘤细胞总数 标识肿瘤丰富的区域富集肿瘤细胞,H&E 染色片用于病理评估 白片用于提取DNA 建议最少切片数： -手术标本，5 m X4 -小活检标本，5 m X8,组织标本来源 手术标本 支气管下活检 经皮穿刺活检 标本处理及贮存 新鲜冻存：液氮或-80C FFPE,检测方法,目前 EGFR 基因突变的检测方法很多 DNA
6、 直接测序法应用广泛，可检测已知的突变和未知的突变，但对标本的肿瘤细胞含量要求较高，一般要求标本中肿瘤细胞的比例在 50% 以上，至少不低于 30%。基于实时荧光定量 PCR 基础上的方法（如 ARMS 法）较直接测序法更加敏感，可检测样品中 1.0%0.1% 的突变基因，更适合用于肿瘤细胞含量较少的小标本检测。 ARMS 方法操作简单，是目前临床上较常用的方法之一，但只能检测已知的突变，且标本需进行预处理，检测费用较高。,直接测序法流程及数据分析,PCR*,纯化,测序反应,测序仪毛细管电泳,纯化,数据分析,EGFR deletion,EGFR L858R,电泳质控,组织标本,DNA,*PCR
7、是关键： -特异性 -产物长度 -必要时巢式 -建议通用测序引物,DNA,ARMS反应,实时定量 PCR,ARMS法操作流程及数据解读,数据分析,内参信号 (HEX),突变信号: + - 内参信号: + +,标本 1 （突变阳性）,标本 2 （突变阴性）,突变信号 (FAM),组织标本,内参信号 (HEX),测序法与ARMS法比较,小结：,了解你的标本 -新鲜/冰冻组织FFPE组织 -手术标本小活检标本 选择合适的方法 -ARMS是目前较敏感快速方法，且容易开展 -测序是传统的方法，但敏感度有限，过程复杂，不易普及 做好组织标本及DNA质控是关键 非肿瘤组织标本的有效利用 -在无肿瘤组织情况下
8、，外周血cfDNA、胸水及细针穿刺等细胞学标本均可用于检测EGFR突变，但其确切的敏感度与特异性尚需进一步探索 -必须选择足够敏感的方法,EGFR激酶抑制剂的耐药性,作为临床上的最大问题，吉非替尼初期有效的全部患者，在后期均产生耐药。其中50%患者是在缺失或L858R等的敏感性突变的基础上，又发生了第790位密码子苏氨酸向蛋氨酸的突变（T790M）。在EGFR-TKI治疗前很少存在T790M（13%22），这种情况下TKI难以有效。 另外50%患者中，其中大约一半患者的耐药性是由MET基因扩增引起的，EGFR-TKI抗药性出现时再进行基因检测，可以选择与其耐药机制相对应的治疗方法。即在一个患者
9、的各种临床情况中，掌握EGFR与相关基因的信息，以期进一步改善临床疗效。,EGFR激酶抑制剂耐药的处理原则,对于缓慢进展的患者，建议继续使用原来的 EGFR-TKI 治疗或 EGFR-TKI 联合化疗； 对于快速进展的患者，推荐停用 EGFR-TKI，改用化疗； 于局部进展且原有病灶控制良好的患者，建议继续使用 EGFR-TKI 并联合局部治疗。,EGFR激酶抑制剂耐药研究进展,第一代EGFR抑制剂Gefitinib (易瑞沙, Iressa)和Erlotinib (特罗凯, Tarceva) 随着其在临床上的广泛应用，耐药问题日益突出。其中，EGFR-T790M突变约占临床耐药病人的60%以
10、上。 第二代EGFR抑制剂Afatinib(阿法替尼)。于2013年9月FDA批准上市，于2014年1月在3期临床研究中以失败告终。Afatinib在体外对EGFR-T790M突变有活性，但临床仍然未能克服T790M突变产生的耐药性。 第三代EGFR抑制剂。国外多个制药公司和研究机构都在开展对T790M突变的小分子抑制剂研究，其中包括克洛维斯肿瘤公司的CO-1686和阿斯利康的AZD9291, 但还没有针对该突变的药物上市。,ALK 融合基因是新发现的 NSCLC 驱动基因，其中棘皮动物微管相关类蛋白 4（EML4）基因与 ALK（间变性淋巴瘤激酶）的融合（EML4-ALK）为最常见类型。AL
11、K 融合基因主要出现在不吸烟或少吸烟的肺腺癌患者，且通常与 EGFR 基因突变不同时存在于同一患者。 NSCLC 患者中 ALK 融合基因的发生率约为 5%，而在 EGFR、KRAS、HER2 或 TP53 等基因无突变的 NSCLC 患者中，ALK 融合基因阳性率达 25%；我国 EGFR 和 KRAS 均为野生型的腺癌患者中 ALK 融合基因的阳性率高达 30%42% 。病理形态学研究提示在含印戒细胞的粘液型或实性腺癌中，ALK的发生率高于其他类型的肺腺癌（46.2% vs 8%） ALK阳性的NSCLC虽然仅占全部NSCLC的5%，但是每年新发病例数在中国仍接近30,000例,ALK融合
12、基因概念,目前检测 ALK 融合基因的常用方法主要有荧光原位杂交技术（FISH）、基于 PCR 扩增基础上的技术和免疫组织化学方法（IHC）。 FISH 目前仍是确定 ALK 融合基因的参照标准方法，但价格昂贵，操作规范要求较高，尚不适用于 ALK 阳性患者的筛查。 实时荧光定量 PCR 操作简便，敏感度高，但需要特定的试剂盒和仪器。 IHC 简便易行、价格便宜、操作方法成熟。VentanaALK 融合蛋白 IHC 诊断试剂盒在不影响特异度的前提下，进一步提高了敏感度，与 FISH 结果的吻合率达到 98.8%，可重复性达 99.7%，已经获 CFDA 批准用于诊断 ALK 阳性的 NSCLC
13、 患者。,ALK融合基因检测方法,ALK融合基因阳性有效靶向药物,针对ALK靶点的小分子抑制剂克唑替尼（Crizotinib）是一种ATP竞争性酪氨酸激酶抑制剂，可特异性靶向抑制ALK激酶，也可抑制c-MET和ROS1等信号通路。 临床试验显示对于ALK阳性的晚期NSCLC患者，克唑替尼的疗效显著优于传统化疗，二线单药治疗患者的中位PFS为7.7个月，有效率达到65.3% 4。基于其良好的疗效和耐受性，2013年初，中国食品和药品监督管理总局（CFDA）已批准克唑替尼用于治疗ALK融合阳性的局部晚期或转移性NSCLC患者 常见不良反应（发生率25%）包括视力障碍、恶心、腹泻、水肿及便秘等,总结,NSCLC 患者治疗前应尽量获取标本，进行 EGFR 基因突变检测； EGFR 检测标本需要经过病理科医生进行质量控制，选用合适的检测方法进行检测，推荐采用高敏感度的检查方法，如 ARMS 法； 对于没有 EGFR 基因突变的患者，建议进行 ALK 和 ROS-1 融合基因检测； 建议有条件的单位同时进行 EGFR 基因突变、ALK 和 ROS-1 融合基因检测。,谢 谢 ！,
