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1、流式细胞术检测原理及在 临床医学中的应用,流式细胞术(flow cytometry FCM)是利用流式细胞仪对单个生物颗粒(红细胞、白细胞、各类组织细胞、血小板、微生物等)以及人工合成微球的物理和生物学特性进行多参数定量分析，并能对特定细胞群体加以分选的分析技术。,流式细胞术的概念,FCM的工作原理,流式细胞仪组成： 1.液流系统 2.光学系统 3.数据处理系统,1.液流系统：由样本和鞘液组成。 待测细胞被制备成单个细胞的悬液，经荧光染料标记的McAb染色后置入样品管中，在清洁气体压力下进入流动室形成样本流。在鞘液 (sheath)的约束下，通过喷嘴，使其形成单细胞液柱。,Flow Cell,
2、鞘液：辅助样本流能被正常检测的基质液 作用： 1.包裹在样本流的周围，使其处于喷嘴中心，以保证检测的精确性； 2.防止样本流中的细胞靠近喷孔壁而堵塞喷孔。,2.光学系统：由激发光源、分光镜、光束成形器等组成。 激光是较常用的光源, 稳定性好、单色性好。 检测信号： 散射光和荧光信号被收集、处理、转化为数字信号。,FCM检测信号,散射光信号 前向散射光（foword scatter, FS）：在激光束正前方的检测器，用于检测细胞或其他粒子物体的表面属性，如大小、形状等。反映细胞颗粒的大小。 侧向散射光（side scatter， SS）：与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器，主要用于检测细胞内部
3、结构属性，可获得细胞内超微结构和颗粒性质的参数。反映颗粒的内部结构复杂程度、表面的光滑程度。 荧光信号 (反映被染上荧光的细胞数量多少）,荧光信号,每种荧光染料都有特定的激发波长，受激光激发后会产生特定波长的荧光和颜色，如绿色、红色、黄色等。流式细胞仪就是利用不同波长的光学滤片来检测这些特定发射波长的光学信号。 荧光信号反映被染上荧光的细胞数量多少。,3.数据处理系统：主要由计算机及其软件组成。 通过检测散射光及荧光信号对实验数据进行分析 存储、显示。 具有智能化、自动化特点。,免疫荧光标记,直接免疫荧光染色法：选用荧光标记的McAb是直接针对细胞表面抗原特异性标志的单一抗体,如抗CD3-FI
4、TC抗体、抗CD4-PE抗体、抗CD8-PeCy5抗体。 间接免疫荧光染色法：选用特异性McAb与相应抗原结合后，再用荧光素标记的第二抗体进行染色。 双标记或多标记分析：目前使用的流式细胞仪能用一个激光束激发检测三色甚至四色荧光信号。检测时需注意荧光补偿。,常用免疫荧光染料组合,荧光补偿： 每两种荧光信号间不可避免会出现重叠现象，重叠区越大，信号检测的准确性就越差，因此需计算机工作软件进行自动跟踪调节补偿。,流式细胞仪的基本功能 细胞表型分析(包括细胞膜、胞浆内蛋白表达及核膜成份分析 DNA含量及细胞周期分析：DNA content analysis，如细胞凋亡检测 细胞分选 cell sor
5、ting 自身免疫性疾病相关HLA抗原分析、自身抗体的检测：如用Hep-2细胞检测抗核抗体。,临床免疫学 临床血液学 临床肿瘤学 血栓与止血 骨髓和器官移植 基础医学研究,流式细胞术的临床应用,FCM在临床免疫学中的应用 (1) 淋巴细胞亚群分析 T细胞： CD3+ CD4+ (Th) CD8+ (Ts/Tc) B细胞： CD19+ NK细胞： CD3- CD16+ CD56+,(2) 淋巴细胞亚群细分 T细胞：Ts：CD8+ CD28- Tc：CD8+ CD28+ Th：CD4+ CD29+ B细胞：B1：CD5+ CD19- B2：CD5 + CD19+,根据T淋巴细胞分泌细胞因子的不同还
6、可将CD4+、CD8+分为 CD4+: Th1: CD4+ IFN-r+ Th2: CD4+ IL4+ Th0: CD4+ IFN-r+ IL4+ CD8+: Tc1: CD8+ IFN-r+ Tc2: CD8+ IL4+ Tc0: CD8+ IFN-r+ IL4+,辅助性T细胞亚群的生物学功能及临床意义 Th1细胞：介导细胞免疫、细胞毒性T细胞的生长和活化、巨噬细胞的活化、介导迟发型过敏反应。其功能亢进将导致炎症慢性迁延，器官特异性自身免疫病，急性排异反应和接触性皮炎等的发病和免疫病理损伤。 Th2细胞 ：介导体液免疫，促进B细胞的生长、活化和分化，是IgG1和IgE类抗体的转换因子，其功能
7、亢进将导致特异性过敏反应，参与高IgE综合症和嗜酸性粒细胞增多症。,(3) 活化淋巴细胞亚群 活化总T细胞： CD3+ /HLADR+ 静止总T细胞： CD3+ /HLADR- 活化CD4+细胞：CD4+ /HLADR+ 活化CD8+细胞：CD8+ /HLADR+ 活化诱导分子： CD69 白细胞介素2低亲和力受体： CD25 CD25+ /CD3+：活化T细胞 CD25- /CD3+：静止T细胞,(4) 淋巴细胞功能分析：细胞介导细胞毒试验、细胞内细胞因子的测定 自身免疫性疾病 变态反应性疾病 免疫缺陷性疾病 感染性疾病(病毒、细菌、寄生虫感染) 免疫治疗监测 肿瘤免疫监测 移植免疫监测,(
8、二) FCM在临床血液学中的应用 1.白血病的MIC分型 Morphology（形态学） Immunology（免疫学） Cytogenetics（细胞遗传学） 白血病分型是选择化疗方案和判断预后的重要依据。白血病免疫分型是MIC分型的重要组成部分，也是对FAB分型的补充，对白血病的诊断、治疗策略制定、预后判断及对白血病发病机制的研究都具有重要作用。,免疫分型的临床意义, 弥补FAB分型的不足 诊断其他血液系统肿瘤 诊断仅表达个别非本系列相关抗原的急性 白血病（LY+AML、MY+ALL） 急性双系或双表型白血病的诊断 骨髓增生异常综合征（MDS）免疫表型分析的临床意义 免疫分型对鉴别慢性淋巴
9、细胞增生性疾病各亚型亦有肯定的诊断价值,以下为各系列较特别的标志： AML： MPO、 CD33、 CDl3、 CDl4 CDl5、 CDllb、 CDllc T-ALL： cmCD3、 CD2、 CD5、 CD7、 CD4CD8、 CD38 B-ALL： cCD22、cCD79、 CDl9、 CDl0、 CD24、 HLADR、 CD20、 CD38 造血干祖细胞: CD34、 CDll7、 CD38、 HLA-DR、 ACl33,在AML各亚型的免疫分型中有时仍较难分辨，有以下特点可供参考： CD41、CD61是巨核细胞的标志，见于FABM7，但 血小板粘附于某细胞上可造成假阳性。 CD7
10、1与血型糖蛋白是红系的标志，见于FABM6型。 CDl4、 CD64是单核细胞的标志，见于M4或M5。 FABM3，t(15；17)者典型的免疫表型是CDl3+、 CD33+、 CD9+、 CD38+、 CD34-、 DR-。 t(8；21)M2的表型为 CDl3+、 DR+、 CD34+、 CD33+、 CDl5+、 CDl9+或CD56+。 M0与M1较难区分，应有髓系标志而无淋系标志，胞浆MPO应阴性。 CD34及DR在M0较强，并可伴有CD7与CD4。, CDll7+多见于AML。 CD7常与CD34共表达， CD4见于M4、M5。 CD2+见于M4Eo，往往伴有16号染色体异常。 M
11、3亦可有 CD56+表达。正常粒细跑可表达 CDl0。由此可见，单抗本身有其多向性，勿轻易判断为杂合型白血病。 TBALL可分为几个亚型，然而对临床价值不大。但若BALL伴有CD34表达时，应进一步作遗传学与基因检测，以确定是否是Ph+ALL，不论是Mbcl/abl或m-bcrablmRNA阳性者，其预后均较差，应接受大剂量化疗或早期接受异基因骨髓移植。,FCM检测白血病微小残留病变(MRD): 过去认为 FCM测定残存白血病细胞不可靠，因为现用的 McAb不能鉴别正常血细胞与白血病细胞。虽然至今尚未发现白血病细胞特异抗原，但近来有人提出根据白血病细胞的以下特征， FCM检测的敏感度可明显提高
12、,白血病细胞的某些抗原表达量明显高于相应的正常血细胞 如小儿ALL，其CDl0+细胞的荧光强度可高达3-4个对数值，而其 CD45则为弱阳性或阴性。 相应正常细胞 CDl0+的细胞荧光强度约为2个对数值， CD45为阳性。若能定量则更可靠。,FCM在临床肿瘤学中的应用 1.血液标本的检查 肿瘤患者的免疫功能检查 肿瘤患者的粘附分子检查 ICAM-1 CD54 ICAM-2 CD102 ICAM-3 CD106 CD62、CD63、CD42a/b、CD41/61、TSP,(2) 肿瘤实体标本的FCM检查 耐药基因检查 粘附分子检查 细胞凋亡检查 细胞DNA分析 增殖性核抗原 肿瘤细胞耐药性筛选
13、肿瘤相关抗原 激素受体 与癌细胞生物行为有关的因子，如CD44,组织标本的正确处理： 去除脂肪、结缔组织 洗涤除去红细胞 用眼科剪剪成肉糜状 用250至350目的铜网过滤 要求： 细胞碎片、细胞连片少，单细胞要多,利用特殊的荧光染料(PI、EB、AO等) 与细胞内DNA碱基结合，被这些荧光染料染色的细胞在激光照射下发射出荧光，荧光强度与DNA含量成正比。流式细胞仪通过测定细胞的荧光强度推算出细胞的DNA含量。,细胞DNA分析原理,细胞周期与DNA的倍体关系,DNA非2倍体出现是鉴别良性与恶性肿瘤的特异性指标: 良性肿瘤和正常组织良性增生不出现DNA非2倍体细胞而恶性肿瘤常可出现异倍体细胞； 实体瘤以多倍体居多； 实体恶性肿瘤的非2倍体出现率70%,淋巴瘤和白血病以亚二倍体居多,出现率达50%。 交界性肿瘤形态学介于良恶性之间,难于监别。如果交界性肿瘤出现异倍体即已具有恶性特征,尽管病理形态学尚不能证实,也应视为恶性。,观察病情演变 判断预后 非整倍体的肿瘤恶性程度高，复发率高，预后差。 近二倍体和二倍体肿瘤 : 预后好。 但少数肿瘤的DNA分析对预后无判断价值。 S期细胞比例的评估对肿瘤恶性程度和预后有意义,高S期肿瘤一般比低S期对化疗敏感。,DNA的倍体和DNA指数的关系,辅助诊断肿瘤 估计肿瘤的预后 监测疗效,细胞DNA分析的临床意义,
