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1、第四章 微生物的遗传变异与菌种选育,第一节 微生物遗传变异 第二节 微生物的菌种选育 第三节 菌种的退化复壮及保藏,第一节 微生物遗传变异,一、遗传与变异的概念 遗传：是指亲代与子代的相似性，它使微生物的性状保持相对稳定，是微生物存在的根据。 变异：是指亲代与子代以及子代之间的不相似性，它使微生物更能适应外界环境的变化，从而促使其在物种上发生进化,第一节 微生物遗传变异,二、常见的微生物表型变异 1、形态和结构的变异 2、菌落变异 3、毒力变异 4、耐药性变异 5、代谢的变异 6、抗原性的变异,第一节 微生物遗传变异,1. 菌落形态变异 在一定条件下，光滑型(S型) 菌落可变为粗糙型(R型)，
2、称为SR变异。S型的抗原丧失，毒力减弱。 2. 抗原变异 由于细菌基因突变而引起其抗原结构发生改变的变异类型。当编码细菌的抗原结构(菌体抗原、鞭毛抗原、荚膜抗原)的基因发生突变时，引起细菌抗原性变异。,第一节 微生物遗传变异,3.抗性变异 是对某种化学药物或致死物理因子抗性的变异。如抗药性变异等，它和化学药物的存在并无关系。 4. 营养型变异 主要引起营养缺陷型变异，即细菌丧失合成一种或几种生长因子能力，无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型。 5 毒力变异,第一节 微生物遗传变异,三、微生物变异的机理 微生物的变异，可分为非遗传性变异(表型变异)和遗传性变异(基因型变异)两种。 非遗传性变
3、异：外界环境条件变化 遗传性变异：微生物的基因发生了改变，使相应的性状也发生变化，并可以遗传下去。 遗传性变异：包括基因突变和基因转移两个方面。,基因突变,一、概念 基因突变指生物细胞遗传物质DNA分子结构突然发生了稳定的可遗传的变化。 按突变范围分：染色体畸变和点突变。染色体畸变指染色体的一大段发生了变化，包括染色体结构上的缺失、重复、插入、易位和倒置。点突变指DNA链中一个或少数几个核苷酸对的改变，包括置换（转换与颠换）、缺失、插人等造成的移码。 按突变原因分：自发突变和人工诱变。人工诱变是人为应用诱变因素使微生物基因发生改变（突变），突变率较高。理化诱变因素如x射线、紫外光、亚硝酸、烷化
4、剂。,基因的转移与重组,细菌的基因转移和重组的主要形式有转化、转导、接合。 1.转化 供体菌游离的DNA片段直接进入受体菌，使受体菌获得新的性状，称为转化。大多数细菌不能接受外源性DNA。,基因的转移与重组,2.转导 以温和噬菌体为媒介，把供体菌的DNA小片段携带到受体菌中，通过交换与整合，使受体菌获得供体菌的部分遗传性状，称为转导。获得新遗传性状的受体菌，称为转导子。,3.接合 是两个完整的细菌通过性菌毛直接接触，由供体细菌将质粒DNA转移给受体细菌的过程。接合性质粒有F质粒、R质粒等。,第二节 微生物的菌种选育,一、从自然界中分离菌种 二、人工诱变育种（简介） 三、杂交育种（简介） 四、原
5、生质体融合育种（简介） 五、基因工程育种（简介）,一、从自然界中分离菌种 （微生物的纯培养技术 ） P75,微生物在自然界中都是混杂地生活在一起。 微生物的纯培养：在实验室条件下将一个细胞或一种细胞群繁殖得到的后代称为纯培养，这一过程称为纯培养的分离。 常用的方法有4种（固体培养基）：,稀释倒平板法（适合霉菌和放线菌）,划线法和涂布法（适合细菌和酵母菌）,选择培养基分离法（适合用于富集培养）,单细胞挑取法（适合单细胞微生物和孢子）,1、稀释倒平板法（最常用）,将待分离的材料作一系列的稀释 分别取不同稀释液少许，与45的琼脂培养基相混合摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中 待琼脂凝固后，保温培养一定时间
6、即可出现菌落,倒平板操作,1,2,3,摇平冷却,倒入量：1520ml 倒入温度：4550,4,2、划线法和涂布法（最简单）,将已熔化的培养基倒入无菌平皿，冷却凝固； 用接种环沾取少许待分离的材料，在平皿培养基表面连续划线（平行、扇形或其他形式），微生物将随着划线次数的增加而分散平板划线 或者弯形玻璃代替接种环在培养基表面涂布亦可 也可在试管培养基斜面划线斜面接种 经保温培养形成菌落。 原理：划线开始的部分细菌分散度小，形成的菌落往往连在一起。由于连续划线，微生物逐渐减少，划到最后，常可形成单个孤立的菌落。这种单个菌落可能由一个细胞繁殖而来（单菌落），故可获得纯培养。,划线法,涂 布 法,涂布接
7、种,3、单细胞挑取法（显微操作）,原理：从待分离的材料中挑取一个细胞来培养，从而获得纯培养。 具体方法：把一滴菌悬液置于载玻片上，用安装在显微镜挑取器上的极细的毛细吸管，在显微镜下对准某一个单独的细胞挑取，再接种到培养基上培养。 此法需要非常熟练的操作人员，多限于高度专业化的科学研究中采用。,4、选择培养基分离法,原理：配制成适合于某种微生物生长而限制其他微生物生长的各种选择性培养基，以达到纯种分离的目的。另外，也可以将待分离的样品先进行适当处理，以消除不希望分离到的微生物。 对一些生理类型比较特殊的微生物，为了提高分离机率，往往在涂布分离前先进行富集培养，其目的是提供一个特别设计的培养环境，
8、促进所需的特殊生理类型的微生物的生长，而不利于其他类型微生物的生长 例如：蛋白酶生产菌的筛选,选择培养基分离法,1.dilute sample,1 ml,9 ml,10 10-2 10- 3 10-4 10-5 10-6 10-7,稀释平板法 既可定性，又可定量，用途广泛 平板划线法 方法简便，多用于分离细菌 单细胞挑取法 局限于高度专业化的科学研究 利用选择培养基法 适用于分离某些生理类型 较特殊的微生物,【小结】4种微生物纯培养分离方法比较,【例】蛋白酶生产菌的筛选,1.采样：根据微生物生理特点采样 采集土壤（哪里的土壤合适？） 肉类加工厂、面粉加工厂、糕点厂附近 2.富集培养（增殖培养）
9、P76 如果蛋白酶生产菌含量过少才需要这一步 方法：设计相应的富集培养基（人为加入相应的底物作惟一碳源或氮源 ）, 3.纯种分离 （纯化）： 方法：稀释平板法、稀释涂布法、平板划线法，如透明圈法（用选择性培养基，把N源去掉，加入酪蛋白）, 4.纯种培养：选出所需菌落的一半进行鉴定，符合要求的转到斜面纯培养。 5.性能鉴定 ：毒性试验和生产性能测定 从自然界中直接获得的新菌株称原始菌株.出发菌株或野生菌株,二、人工诱变育种（简介）,诱变育种工作程序 P77,诱变剂,物理：紫外线,化学：烷化剂,出发菌株,大多死亡,少数存活,多数未变,少数突变,多数负变,少数正变,存活率,突变率,正变率,高产率,投
10、产率,多数幅度小,少数 幅度大,多数不宜投产,少数适宜投产,诱变,三、杂交育种（简介）,核减数分裂或有丝分裂,有性或无性孢子、细胞,AA,aa,AAaa,AA Aa aa,分离、筛选,生产菌株,方法复杂，进度慢， 应用不广。,四、原生质体融合育种（简介）,原生质体(protoplast)： 指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露球形细胞。,优点： 重组率高；可实现远亲缘菌株之间的基因重组，应用愈加广泛。,【例如】植物体细胞杂交过程图,五、基因工程育种（简介）,例如：基因工程菌生产胰岛素,供体,受体,基因工程菌,第三节 菌种的退化复壮和保藏,一、微生物的遗传和变异现象【复习】 二、菌种退
11、化的原因及防止措施 三、菌种的保藏原理及方法 四、菌种的复壮措施,一、微生物的变异,1.突变：遗传物质中的核苷酸顺序发生量稳定的可遗传的改变。 2。突变的分类： 基因突变、染色体畸变（突变范围的不同） 自然突变、人工突变（突变诱因的不同） 正突变、负突变（突变效果的不同） 3.微生物变异表现在一下几个方面： 形态变异 结构变异 代谢特性变异：营养缺陷型 毒性变异：增加或减弱 抗药性变异：,二、菌种退化的原因及防止措施P81,（一）常见的菌种退化现象：主要表现在生产性能降低 （二）菌种退化的主要原因有关基因的负突变 处于旺盛生长及繁殖的细胞发生突变的机率 处于休眠状态的细胞发生突变的机率 （三）
12、防止菌种退化的措施 1控制传代次数 2创造良好的培养条件 3利用不同类型的细胞进行移种传代 4采用有效的菌种保藏方法,三、 微生物菌种的保藏,（一）菌种的保藏原理,挑选典型菌种的优良纯种 一般采用微生物的休眠体（如孢子、芽孢等） 人工创造适于微生物长时期休眠的环境条件 如干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养以及添加保护剂等。,菌种保藏机构的任务：广泛收集实验室和生产菌种、菌株（包括病毒株以及动、植物细胞株和质粒等）的基础上，使之达到不死、不衰、不乱以及便于研究、交换和使用的目的。 常用的菌种保藏机构： 中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM) 美国的典型菌种保藏中心(ATCC) 日本大阪发酵研究所（
13、IFO）,（二）菌种的保藏方法,1斜面低温保藏法 斜面菌种直接放入04冰箱中保藏，保存时间不宜过长，一般为 36个月； 用-20以下的超低温冰箱或干冰、液氮（-195）冻结保藏，长达数年。 2干燥保藏法 主要是指把菌种接种到适当载体上，在干燥条件下进行保藏。这种保藏方法主要适合于细菌的芽胞和霉菌的孢子。细菌芽胞用沙土管保藏；霉菌的孢子多用麸皮管保藏。 3隔绝空气保藏法（好氧微生物） 用无菌液体石蜡封藏斜面试管以隔绝空气，4冰箱保藏。 4真空冷冻干燥保藏法（利用了一切菌种保藏有利因素） 培养菌种加菌种保护剂（一般食品工业用菌种多用牛乳作保护剂）分装、预冻真空冻干真空封口。,几种常用菌种保藏方法的
14、比较,四、菌种的复壮措施,纯种分离 菌落纯的分离方法（平板表面涂布法，平板划线分离法，琼脂培养基浇注法） 细胞纯的分离方法（分离小室进行单细胞分离，显微操纵器进行单细胞分离，菌丝尖端切割法进行单细胞分离） 通过宿主体内生长进行复壮（如Bacillus thuringiensis的复壮） 淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退个体） 改变培养条件 最常用的是改变营养成分、酸碱度或培养温度。,【小结】菌种的退化复壮和保藏,一、微生物的遗传和变异现象 二、菌种退化的原因及防止措施 三、菌种的保藏原理及方法 四、菌种的复壮措施,复习思考题,微生物的菌种选育方法有哪些？ 从自然界中分离菌种的程序如何？常用哪些手段？ 如何从土壤中分离出淀粉酶产生菌？ 菌种退化的原因是什么？退化主要表现在哪些方面？如何防止？ 菌种衰退以后如何进行复壮？ 菌种保藏的基本原理是什么？常用的方法有哪些？,
