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1、微生物制药,b-内酰胺抗生素,第一节 定义,分子中含有-内酰胺环并具有抗菌作用的一类化学物质。,第二节 分类和命名,青霉烷(penams),青霉烯(penems),碳青霉烯(carbapenems),头孢烯(cephems),碳头孢烯(carbacephems),氧头孢烯(oxocephems),一、b-内酰胺抗生素的分类,一、b-内酰胺抗生素的分类（续）,单环-内酰胺 (monobactams),青霉烷砜 (penicillanic acid),氧青霉烷 (棒烷) (oxopenams),二、 -内酰胺抗生素的命名,青霉烷类（cillin，西林） 头孢烯类（cef，头孢） 青霉烯类（pene
2、m，配能） 氧头孢烯类（oxef，氧头孢） 碳头孢烯类（carbef，碳头孢） 单环内酰胺类（onam，喃） -内酰胺酶抑制剂类（-lactamase inhibitors） 复合-内酰胺抗生素（-内酰胺抗生素+-内酰胺酶抑制剂）,三、青霉素的分类,生物合成的-内酰胺抗生素,第三节 生物合成与代谢调控,青霉素与头孢菌素的生物合成途径 生物合成中的调控反应,青霉素G,苯乙酸 （侧链）,6-氨基青霉烷酸（6-APA) (母核),苯乙酸,半胱氨酸,缬氨酸,青霉素与头孢菌素的生物合成途径（一）,L-氨基己二酸,L-半胱氨酸,L-缬氨酸,ACV合成酶,LLD-ACV,IPN合成酶,IPN异青霉素N,青霉
3、素与头孢菌素的生物合成途径（二）,IPN酰基转移酶,IPN酰化酶,青霉素G,6-APA,青霉素与头孢菌素的生物合成途径（三）,异构酶,DOCPC羟化酶,DOCPC合酶,DCPC乙酰转移酶,异青霉素N,青霉素N,脱乙酰氧头孢菌素C,脱乙酰头孢菌素C,头孢菌素C,碳源调控（葡萄糖效应）：速效碳源 青霉素、头孢菌素、棒酸发酵 NH4+调控：NH4+ 青霉素、头孢菌素发酵 氨基酸调控：赖氨酸 青霉素、头孢菌素发酵，蛋氨酸 头孢菌素发酵 pH调控（影响通透酶） 磷酸盐调控（一般与碳源调控相联系） 注：“ ” 表示抑制或阻遏，“ ” 表示促进或刺激。 调控反应的控制：用流加方法控制效应物在发酵液中的残留浓
4、度,生物合成中的调控反应,第四节 青霉素的工业生产,工艺流程发酵,产黄青霉,真空冷冻干燥或液氮保藏孢子,斜面孢子,琼脂培养基上25培养79天,米孢子,用斜面孢子悬浮液接种于大米或小米基质上25培养67天,种子罐,用孢子米粒或孢子悬液接种，26通气、搅拌培养6068小时,发酵罐,用种子罐按10%15%体积接种，在25及通气、搅拌下补料分批培养200240小时,发酵液,冷却至5左右，絮凝、过滤,发酵滤液,补料： 葡萄糖 硫酸铵 氨水 苯乙酸或苯氧乙酸 消沫剂,第四节 青霉素的工业生产,工艺流程提炼,第四节 青霉素的工业生产,青霉素发酵的主要工艺控制点,青霉素生产菌种产黄青霉(Penicillium
5、 chrysogenum)的分生孢子,第四节 青霉素的工业生产,第四节 青霉素的工业生产,青霉素发酵过程主要变量的典型变化曲线,青霉素生产工艺要点（一）,生产菌种的长期保存要采用孢子悬浮液液氮低温（-196）存放或真空冷冻干燥管冷藏（4）的方法，而不采用传统的沙土管保藏方法，以便在较长时间（510年）内保持菌种的存活和生产能力稳定。 琼脂斜面种子（孢子）密封后在415下可以短时间保存，但最好不要超过3个月。 米孢子的基质可以是大米或小米，培养成熟后密封可以在415下保存不超过3个月；如果在密封前真空干燥，则可以保存不超过6个月。 种子罐以达到对数生长的后期为培养成熟指标，不能随意延长或缩短培养
6、时间；同时要考虑培养液的流动性，以不影响通过管道向发酵罐接种的速度为宜。,青霉素生产工艺要点（二）,发酵罐的发酵条件要严格按工艺要求进行控制，特别是各项补料要适应工艺对溶氧、pH及维持量的要求，不能过量，也不能不足；为了减少过程空气湿度对发酵液体积的影响，在湿度偏高或偏低的季节，要适当提高或降低用于补料的糖液浓度。 氨水既作为发酵的氮源，又用来调节发酵过程中的pH，它的补入要根据发酵液的pH和铵氮含量与补硫酸铵协调进行。 发酵液过滤要尽量提高速度，缩短时间，为此一般需要在过滤前对发酵液进行絮凝处理，絮凝剂的加入量随絮凝剂种类不同而异，以达到最大絮凝效果而不过量为宜。 除种子制备和发酵过程要严防
7、杂菌侵入外，提取的各工序也应尽量保持无菌，因为污染细菌极有可能产生能破坏青霉素的青霉素酶；特别是过滤，由于操作时间长，料液营养丰富，容易滋生杂菌，故必须定期对设备和过滤介质进行清洗和灭菌，必要时可在过滤前加入4福尔马林防腐。,青霉素生产工艺要点（三）,青霉素对热、酸、碱都不稳定，而萃取操作正好处于不稳定pH范围内，故萃取过程要尽量降低温度，缩短时间，以减少青霉素的降解；离心萃取速度快，青霉素在不稳定pH下维持时间短，是目前生产上普遍采用的方法。 由于一次萃取对象的发酵滤液中含有不少可溶性蛋白质，容易在萃取界面形成乳化层，影响萃取和相分离，故应尽可能提高发酵液过滤质量，并在萃取过程中加入适量破乳
8、剂。 结晶操作要掌握好晶体形成的速度，以达到理想的晶形和晶粒大小；为此，必须控制结晶时的温度和结晶反应剂加入的速度，并保持适当转速的搅拌。 提取过程中使用的过程水、溶媒及其它原辅料，都要有严格的质量要求，设备、周围环境和操作人员也要严格保持清洁，以避免带进杂质和杂菌，影响产品质量。,第五节 头孢菌素C的工业生产,生产菌种：枝顶头孢（Cephalosporium acremonium），又称产黄枝顶孢（Acremonium chrysogenum）。 生产流程：枝顶头孢 斜面培养 摇瓶培养 种子罐 发酵 过滤 超滤 吸附 解吸 吸附 解吸 锌络合 结晶 过滤 干燥 头孢菌素锌盐,第五节 头孢菌素
9、C的工业生产,工艺控制点： 发酵液残油：微量，但离心后肉眼可见； 铵氮：0.50.7 g/L； pH：6.5。,原料消耗,Cephalosporium acremonium 的气生菌丝和孢子囊,Cephalosporium acremonium 的菌丝和节孢子,节孢子,第六节 半合成青霉素和头孢菌素的生产,6-氨基青霉烷酸（6-APA） 的酶法生产工艺原理：,青霉素G,6-APA,苯乙酸,青霉素酰胺酶作用点,+,第六节 半合成青霉素和头孢菌素的生产 6-氨基青霉烷酸（6-APA）的酶法生产,工艺流程：E. coli 或 Bacillus megaterium 培养 青霉素酰胺酶分离、纯化 酶包
10、埋 青霉素G钾 磷酸盐缓冲液* 固定化酶柱 萃取 结晶 (*pH 8.4) 苯乙酸 结晶 萃取 母液 以上各步的收得率为：青霉素G裂解95%96%，6-APA分离和纯化97%，苯乙酸分离和纯化80%。生产1 kg 6-APA约需2 kg青霉素G钾。回收的苯乙酸可用作青霉素发酵前体。固定化酶柱可反复使用，使用次数不少于500次。,6-APA,第六节 半合成青霉素和头孢菌素的生产 7-氨基脱乙酰氧头孢烯酸（7-ADCA）的生产,注：裂解所用的酶与制备6-APA的酶是同一种酶，并采用同样的方法固定、装柱。按目前的生产水平，生产1 kg 7-ADCA大约需要消耗 2.5 kg青霉素G钾。苯乙酸的回收率为75%80%。,
