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1、微生物药物产生菌的保藏和质量控制,刘红宇,2,微生物药物产生菌 微生物药物产生菌菌种管理 微生物药物产生菌菌种退化 微生物药物产生菌菌种保藏与质量控制,主要内容,微生物药物产生菌主要包括细菌、放线菌和真菌。被描述的微生物药物大约近两万种。,抗细菌:青霉素(Penicillin) P. notatum 降血脂:他汀类(Statins) P. brevicompactum, A. terreus, Monascus ruber 免疫抑制剂:环孢素(Cyclosporin A) Tolypocladium inflatum 抗真菌:棘白霉素类(Echinocandins) A. nidulans,一
2、、微生物药物产生菌,实验室必须建立和保存其所有菌种的进出、收集、贮藏、确认试验以及销毁的记录，应有菌种管理的程序文件2015中国药典 标准菌种的申购记录； 从标准菌株到工作菌株操作及记录； 菌种必须定期转种传代，并做纯度、特性等实验室所需关键指标的确认，并记录； 每支菌种都应注明其名称、标准号、接种日期、传代数； 菌种生长的培养基和培养条件； 菌种保藏的位置和条件； 其他需要的程序.,二、微生物药物产生菌菌种管理,二、微生物药物产生菌菌种管理,对 活 纯 性状稳定,微生物菌种实物管理 微生物菌种信息管理 保证菌种实物与信息的一致性,实物管理,信息管理,二、微生物药物产生菌菌种管理,菌种的来源
3、应来自认可的国内或国外菌种保藏机构的标准菌株， 使用与标准菌株所有相关特性等效的可以溯源的商业派生菌株。 -2015版中国药典,实物管理,信息管理,标准菌株的复苏、复壮或培养物的制备应按供应商提供的说明或按已验证的方法进行; 标准菌株如果经过确认试验证明已经老化、退化、变异、污染等或该菌株已无使用需要时，应及时灭菌销毁； 标准储备菌株应进行纯度和特性确认。 -2015版中国药典,二、微生物药物产生菌菌种管理,实物管理,信息管理,微生物药物产生菌菌种退化,微生物药物产生菌经过多次传代或长期保持菌种的一个或多个优良特性逐步减退或消失，称为微生物药物产生菌菌种的退化。,三、微生物药物产生菌菌种退化,
4、在实际生产中，培养条件的变化也会导致菌种形态和生理上的变化，但是只要培养条件恢复正常，菌种原有性能就能恢复正常，因此培养条件引起的菌种变化是不能称为菌种退化的。,药用微生物产生菌菌种退化的鉴别,微生物药物产生菌菌种退化,微生物药物产生菌菌种退化主要表现在微生物的形态、生理特性及微生物药物生产能力等方面的变化： 1.细胞形态改变，产孢子能力下降。 2.培养特征异常，典型性状变为不典型。 3.对不良环境如低温、高温条件或噬菌体的侵染的抵抗力下降。 4.营养需求发生改变。 5.在生产上常见的退化现象有：微生物药物生产能力下降，生产的速度变慢。,三、微生物药物产生菌菌种退化,防止微生物药物产生菌菌种退
5、化的方法,三、微生物药物产生菌菌种退化,1.控制转接传代次数 2.采用良好的培养条件 3.采用有效保藏方法,微生物药物产生菌菌种退化的原因,1.自发突变与回复突变 2.细胞本身自我调节和修复 3.环境条件的影响,适合的菌种保藏方法保证菌种的存活 并防止菌种退化,冷冻干燥保藏法 -80度低温冷冻法 液氮超低温保藏法,四、微生物药物产生菌菌种质量控制-保藏方法,低温冷冻干燥、液氮贮存、超低温冷冻（低于-30）等方法保存； 低于-70或低温冷冻干燥方法可以延长菌种保存时间。 -2015版 中国药典,四、微生物药物产生菌菌种质量控制-保藏方法,冷冻干燥保藏法,冷冻干燥保藏法是将菌种悬液在冻结状态下升华
6、其中的水分,使得菌种处于干燥、低温和缺氧的条件下，从而得以长期保存的菌种保藏法。 原理：将含水量大的微生物菌种预先冷冻在真空条件下利用升华现象除去水分，细胞的生理活动趋于停止，从而能够长期维持生活状态。 适用范围：大多数细菌和放线菌。部分真菌和酵母菌。 优点：保存时间长、输送、贮存方便等优点。 缺点：冷冻干燥过程对细胞有损伤,操作步骤繁多，需要一定设备。,四、微生物药物产生菌菌种质量控制-保藏方法,冷冻干燥保藏法,四、微生物药物产生菌菌种质量控制-保藏方法,安瓿管准备,酸洗,水洗,蒸馏水洗,加标签及棉塞,灭菌,菌种,制备菌液,培养 （固体或液体）,分装安瓿管,安瓿管预冻,冷冻干燥开始,适当升温
7、（促进干燥）,冻干结束,安瓿管封口,检查真空度,保护剂的选择与准备,分装,灭菌,保藏（低温避光）,冷冻干燥过程的影响因素,四、微生物药物产生菌菌种质量控制-保藏方法,冷冻干燥保藏法的影响因素,微生物菌种不同发育阶段 菌体浓度 降温速率 保护剂、抗诱变剂及修饰剂的使用 合适的冻干曲线 二次抽真空 复水及培养条件,四、微生物药物产生菌菌种质量控制-保藏方法,2019/4/20,-80度低温冷冻法,将欲保存的菌种悬液密封于冻存管后储藏于-80的冰箱中的保藏方法。 原理：使微生物处于低温状态下使细胞的代谢减缓或趋于停止。 适应范围：各种类型微生物。 优点：简便有效，在没有液氮的地区购置深冻冰箱保藏菌种
8、较易推广。 缺点：断电或机械故障菌种易融化死亡。,四、微生物药物产生菌菌种质量控制-保藏方法,2019/4/20,液氮超低温保藏法,将欲保存的菌种悬液密封于冻存管中，经控制速度冻结后，储藏于-196 的液态氮或-150的气态氮中的长期保藏方法称为液氮超低温保藏法。 原理：微生物在-130以下新陈代谢趋于停止。在此温度下保藏，微生物处于休眠状态，可减少死亡或变异。 优点：保存时间长,死亡率低,变异少,活性相对稳定。 缺点：某些地方液氮不易得到 适用范围：各类微生物,四、微生物药物产生菌菌种质量控制-保藏方法,-80度低温冻结与液氮保藏比较,四、微生物药物产生菌菌种质量控制-保藏方法,2019/4
9、/20,-80度低温冷冻法 & 液氮超低温保藏法的影响因素,微生物菌种的发育阶段 菌体浓度 降温速率 保护剂、抗诱变剂及修饰剂的使用 升温速率及培养条件,四、微生物药物产生菌菌种质量控制-保藏方法,微生物菌种不同发育阶段 与保藏的关系,细菌和酵母菌冻干静止期菌龄的细胞，其存活率高于对数生长期和衰老期的细胞，幼龄和老龄细胞均不适用。 对于放线菌要求形成成熟的孢子为宜，而幼龄和老龄的细胞对冻干比较敏感。,四、微生物药物产生菌菌种质量控制-影响保藏因素,菌体浓度对于抗生素产生菌存活力的影响,四、微生物药物产生菌菌种质量控制-影响保藏因素,控制降温速率,D.Smith等人应用温控冷冻光显微术（Temp
10、erature-controlled Crygenic Light microscopy）观察真菌在冷冻与融化过程中引起细胞的损伤情况。发现不同种对于冷冻产生不同反应冷冻光显微术的使用，可以更直接观察到冷冻速率对细胞的影响，指导降温速率的控制，提高菌种的遗传稳定性。,四、微生物药物产生菌菌种质量控制-影响保藏因素,控制降温速率,四、微生物药物产生菌菌种质量控制-影响保藏因素,据报道酵母合适的冷冻速度为3-10/min，乳酸菌为3-5/min，放线菌为1/min。,使细胞在冻干过程中免于死亡或损伤，并减少在保藏过程中的死 亡； 作为支持物和受体在复水过程中为干物质提供一定的骨架结构，防止复水时引
11、起的死亡，并使菌体容易从休眠状态恢复为生长发育状态。 据报道适合的保护剂可以使微生物细胞的成活率接近99.8%。保护剂是保护性溶质，通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲合力来稳定细胞成分的构型，保护剂可替代结合水而稳定细胞的构型。对某些微生物，加保护剂反而有害。,保护剂的作用,四、微生物药物产生菌菌种质量控制-保藏影响因素,很多菌种保藏机构如美国ATCC采用的保护剂多达有100多种。如脱脂牛奶、甘油、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、藻酸等通常与其他物质混合使用。,保护剂的种类,四、微生物药物产生菌菌种质量控制-保藏影响因素,不同保护剂对冷冻干燥后抗生素产生菌存活率的影响,不同保护剂对冷冻干燥后抗生素产生菌
12、生产能力的影响,四、微生物药物产生菌菌种质量控制-保藏影响因素,不同保护剂对冷冻干燥后抗生素产生菌生产力的影响,四、微生物药物产生菌菌种质量控制-保藏影响因素,抗诱变剂及修饰剂的使用,在菌种保藏过程中添加抗诱变剂可以减少突变体产生，阻碍诱变剂同DNA的相互作用。抗诱变剂具有高度特异性。 抗诱变剂主要有：嘌呤核苷酸、锰离子、L-甲硫氨酸、组氨酸、精胺、多氨、咖啡因等。 近年来还发现一些修饰剂（如对氨基苯甲酸）对于链霉菌性状的稳定有实际意义。,四、微生物药物产生菌菌种质量控制-影响保藏因素,共晶点的概念,四、微生物药物产生菌菌种质量控制-影响保藏因素,溶液随温度降低而发生凝固冻结，达到全部凝固冻结
13、的温度称为凝固点或称共晶点。不同物质的凝固点不同。由于冻干是在真空状态下进行的，只有制品全部冻结后才能在真空下进行升华。,保护剂与共晶点,四、微生物药物产生菌菌种质量控制-保藏影响因素,Eutectic Temperature, Glass-Transition Temperature, and Temperature Primary Drying Phase of Various Lyoprotectants,Na-gl, Na-glutamate; sm, skim milk; Teut, eutectic temperature; Tg, glass-transition tempera
14、ture; T prim. Dr. phase, primary drying phase; tr, trehalose.,共晶点的测定,四、微生物药物产生菌菌种质量控制-保藏影响因素,当温度降低时电阻增大，当降到共熔点时电阻即出现突然增大现象，此时的温度即是该溶液物质的共熔点。,1.保藏方法各个环节的细化和完善 降温速率的控制 保护剂 抗诱变剂的种类增多 共晶点测定 适合的冻干曲线 2.玻璃化速冻 部分真菌保藏,四、微生物药物产生菌菌种质量控制-保藏方法新进展,网址: http:/ 地址: 北京市天坛西里1号，中国医学科学院医药生物技术研究所 邮编: 100050 微生物菌种购买和保藏, email: Tel: 01063161934 微生物菌种鉴定 email: Tel: 01083167110,欢迎与我中心 合作研究！,
