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1、基因重组 凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式，称为基因重组或遗传重组。 作用：重组可使生物体在未发生突变的情况下，也能产生新遗传型的个体。 在基因重组时，不发生任何碱基对机构上的变化。,一、杂交 重组是分子水平上的一个概念，可以理解成是遗传物质分子水平上的杂交。 一般所说的杂交则是细胞水平上的一个概念。 杂交中必然包含着重组，而重组则不限于杂交这一形式。,二、转化 受体菌自然或在人工技术作用下直接摄取来自供体菌的游离DNA片段，并把它整合到自己的基因组中，而获得部分新的遗传性状的基因转移过程，称为转化。 转化发生的条件： 受体细胞要处于
2、感受态；供体DNA片段大小适宜，分子量一般为1107 D 左右；菌株间的亲缘关系密切。 转化的类型：自然遗传转化和人工转化。,感受态：受体细胞能从环境吸取外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态。只在细菌生长的某一时期出现；不同菌种的感受态出现在不同生长时期。 转化因子：本质是供体DNA片段。 一般的转化因子都是线状双链DNA；也有少数报道认为线状单链DNA也有转化作用。,转化的过程 以肺炎链球菌抗链霉素菌株为例，大致可分为六阶段： 吸附：双链DNA片段与细胞表面的特定位点（主要在新形成细胞壁的赤道区）结合，此时，细胞膜上的胆碱可促进这一过程。在吸附过程的前阶段，如外界加入DNA酶，就会减少转
3、化子的产生。稍后，DNA酶即无影响，说明此时该转化因子已进入细胞；,切割：在吸附位点上的DNA被核酸内切酶分解，形成平均分子量为45106的DNA片段； 入胞：DNA双链中的一条单链被膜上的另一种核酸酶切除，另一条单链逐步进入细胞，这是一个耗能的过程。分子量小于5105的DNA片段不能进入细胞。这时如用低浓度溶菌酶处理，因它提高了细胞壁的通透性，故可提高转化频率；,重组：来自供体菌的单链DNA片段在细胞内与受体细胞核染色体组上的同源区配对，接着受体染色体组上的相应单链片段被切除，并被外来的单链DNA交换、整合和取代，于是形成了一个杂合DNA区段（heterozygous region）。在这一
4、过程中，有核酸酶、DNA聚合酶和DNA连接酶的参与；,复制：受体菌的染色体组进行复制，杂合区段分离成两个，其中之一获得了供体菌的转化基因，另一个未获供体基因； 转化子形成：当细胞发生分裂后，一个子细胞含供体基因，这就是转化子；另一个细胞与原始受体菌一样。,转化的过程,三、转导 以温和噬菌体为媒介，将供体细胞的DNA片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导。获得新遗传性状的受体细胞，称转导子。,转导的种类：,完全普遍转导 普遍转导 流产普遍转导 转导 低频转导 局限转导 高频转导,1、普遍性转导 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何DNA小片段的“误包”而实
5、现其遗传性状传递至受体菌的转导现象，称为普遍性转导。 1）完全(普遍性)转导 P22在供体菌内增殖时，宿主的核染色体组断裂，待噬菌体成熟与包装之际，极少数（10 6 10 8）噬菌体的衣壳将与噬菌体头部核心大小相似的一段供体DNA片段误包入其中，形成了一个完全不含噬菌体自身DNA的缺陷噬菌体。,供体菌裂解时，如把少量裂解物与大量受体菌群体相混，使其感染复数1，这种完全缺陷噬菌体就会将这一外源DNA片段导入受体细胞内。 在这种情况下，由于一个受体细胞只感染了一个完全缺陷噬菌体，故受体细胞不会发生往常的溶原化，也不显示其免疫性，更不会裂解和产生正常的噬菌体；而由于导入的外源DNA片段可与受体细胞核
6、染色体组上的同源区段配对，在通过双交换而整合到受体菌染色体组中，所以使后者成为一个遗传性状稳定的转导子。,完全普遍转导,2）流产普遍性转导 受体菌经转导获得的供体DNA片段在受体菌中不发生配对、交换和整合，也不迅速消失，而只是进行转录和转译（性状表达），这种现象就称为流产转导。 现象：发生流产转导的细胞在其进行细胞分裂后，只能将这段外源DNA分配给一个子细胞，而另一子细胞仅获得供体基因的产物酶，在表型上表现出轻微的供体菌特征，每经过一次分裂，就受到一次稀释，,所以，能在选择性培养基平板上形成微小菌落就是流产转导的特点。,2、局限性转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌
7、中，并获得表达的转导现象。 特点：噬菌体对供体菌和受体菌都是温和噬菌体；只能转导供体菌的个别特定基因（一般为噬菌体整合位点两侧的基因）；该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带；缺陷噬菌体使由于其在形成过程中所发生的低频率（约10 5）“误切”，或由于双重溶源菌的裂解而形成（约形成50%缺陷噬菌体）。,1）低频转导（LFT） 一般的转导现象中，从宿主染色体上切离时发生不正常切离的频率极低，故这种裂解物中的部分缺陷噬菌体的比例是极低的（104106）。把这种裂解物称为LFT（低频转导）用LFT裂解物以低 m.o.i（感染复数）感染宿主，就可获得极少量的局限转导子，即低频转导。,2）高频转导（HFT） 当
8、用LFT裂解物以高m.o.i （感染复数）感染E. coli gal（不发酵半乳糖的营养缺陷型）菌株时，凡是感染有dgal噬菌体任一细胞，几乎都同时感染有正常的噬菌体。这时与dgal同时整合在一个受体菌的核染色体组上，从而使它成为一个双重溶源菌。当双重溶源菌被紫外线等诱导时，其中的正常噬菌体的基因可补偿dgal缺失的部分基因功能，因而两种噬菌体就同时获得复制的机会。所以在双重溶源菌中的正常 噬菌体被称为助体（或辅助）噬菌体。,双重溶源菌的裂解物中含有等量的 和dgal粒子，称为HFT（高频转导）裂解物。 用HFT裂解物以低 m.o.i （感染复数）感染另一个E. coli gal（不发酵半乳糖
9、的营养缺陷型）受体菌，就可以高频率地把它转化为能发酵半乳糖的E. coli gal+ 转导子。是为高频转导。,基因工程 基因工程：用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质-DNA大分子提取出来，在离体的条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中使供体DNA进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新的育种技术。 基因工程在食品工业中的应用： 工程菌的构建（外源基因的表达、工业发酵用菌种的改造） 工业用酶蛋白的改性（第二代基因工程）,一、基因工程技术 基因工程操作一般分为以下四个步骤： 目的基因的取得 载体的选择 目
10、的基因与载体DNA的体外重组 重组载体引入受体细胞,获得目的基因的主要方法： （1）从供体细胞的DNA中分离（酶切法、PCR扩增）。 （2）通过反转录酶的作用由mRNA合成cDNA（拷贝数少的目的基因的获得）。 （3）由化学方法合成特定功能的基因（磷酸二酯法、磷酸三酯法、固相亚磷酸三酯法，合成的长度150200bp，作用：合成基因的元件、合成引物、合成探针、用于基因的定点诱变、作为重组DNA连接的构件）。,载体的选择 载体必须具备的几个条件： （1）必须是一个复制子； （2）在受体细胞中有较高的复制率； （3）最好只有一个内切酶切口； （4）必须具有选择性遗传标记。 目前常用载体： （1）质粒
11、载体； （2）噬菌体载体； （3）柯斯质粒载体（噬菌体DNA的COS序列和质粒复制子构成的特殊类型的质粒载体）。,目的基因与载体DNA的体外连接 核酸内切酶与DNA分子的体外切割： 在基因工程中，必须使用特定的内切酶（一般为型内切酶）消化目的基因与载体DNA，使它们产生互补的粘性末端或平末端，如E.coli消化DNA 产生的粘性末端为： G3 5AATTC CTTAA5 3G,目的基因与载体DNA用同一种内切酶消化，即产生相同的粘性末端，在低温（5-6）下进行退火时，互补的粘性末端配对重新形成带缺口的双链。 DNA连接酶进行目的基因与载体DNA的体外连接： 粘性末端连接（来源于E.coli的DNA连接酶）；平末端连接（ T4 DNA连接酶）。,重组载体引入受体细胞 受体细胞的种类： 微生物细胞（E.coli B.subtilis S.cerevisiae） 植物细胞 动物细胞 重组载体引入受体细胞的方法： 转化 转染,二、基因工程的应用及发展前景 基因工程在工业、农业、医疗、环保方面的应用。 基因工程与基本理论研究的关系。 基因工程的展望,
