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1、,研究程序 有效成分的提取方法 有效成分的分离纯化方法 结构研究方法,第二章 天然产物提取分离方法,第一节 研究程序,资源调查,资料收集,样品采集 天然产物的提取 活性追踪 天然产物的分离纯化 结构鉴定,一、研究程序,资源调查资料收集,成分预试,提取,有效成分分离纯化,部位分离,活性初筛,活性追踪,结构鉴定,结构查新,应用,结构改造 仿生合成,经济分析,技术保护,高通量筛选技术,二、资源调查,包括资源实地调查和文献调查。 资源实地调查：分布、储量、有效部位、综合利用价值、开发前景等基础资料。 文献调查：旨在查阅前人（国内、国际）对同属、同科或同种植物的研究状况，如化学成分的研究方法、水平、技术
2、条件、经验教训及进展等。 植物选择： 当地随机；分类学；民族医药；植化方法；信息网络；机遇。,例：番荔枝内酯： 研究状况1996前128个；1997：250；1998：300 抗癌药物与杀虫剂。,三、成分预试,依据植物体内各类化学成分的溶解性、挥发性、吸附性等差异粗分离后，再利用颜色反应、沉淀反应、气体反应、荧光反应等定性试验大致了解其中含有哪几类化合物。 有单项预试和系统预试两类。,有机化合物分为三类,水溶性,亲脂性,亲水性,苷类（黄酮、三萜、甾体 等与糖的结 合物）,糖类、氨基酸蛋白质、盐类,未成盐的生物碱，未成苷的黄酮、蒽醌、萜类、甾体。,化合物的酸碱性,酸性化合物,碱性化合物,两性化合
3、物,酸性成分 黄酮、蒽醌、香豆素、有机酸、鞣质,中性成分 强心苷、皂苷（甾体）,碱性成分 生物碱,两性成分 两性生物碱（含COOH 、OH 等）,极性分类,脂溶性成分：苷元、生物碱 水溶性成分：苷、生物碱盐,按溶解性分类,常见中药化学成分类型的极性,各成分及其适宜的提取溶剂,第三节 天然产物的提取,根据预试和筛选结果，采用合适方法将所需成分尽可能全部从生物材料中提取出来。在这里我们对天然产物的提取着重于提取植物中的有效成分，那么，什么是有效成分呢？由于植物中含有许多化学成分，但并不是所有的成分都能起到防治疾病的作用， 根据实践经验和科学认识水平，通常将植物中的化学成分分为有效成分和无效成分两类
4、。,有效成分：一般是指具有生理活性、能用分子式和结构式表示并具有一定的物理常数（如熔点、沸点、旋光度、溶解度等）的单体化合物 。 如果尚未提纯成为单体化合物的，一般称为有效部分或有效部位；而与有效成分共存的其它化学成分，则一般视为为无效成分。 有效成分和无效成分的划分也不是绝对的。 例如鞣质，在多数中药中对治疗疾病不起主导作用，被视为无效成分，而在地榆、五倍子等中药中因其具有收敛、止血和抗菌消炎作用，则被认为是有效成分。 另外，随着科学技术的发展，有些过去认为无效的成分如某些多糖、蛋白质，现已发现它们分别具有抗癌活性，故也应列为有效成分。,提取技术分类,预处理技术 干燥技术 超微粉碎技术 天然
5、产物传统提取技术 溶剂提取法 水蒸汽蒸馏法 升华法,现代提取技术 超声辅助萃取技术 超临界流体萃取技术 微波辅助萃取法 吸附技术 其它新技术,一、预处理技术,除杂/整形/均匀化 干燥技术： 阴干 蒸后烘干 烘干 晒干 微波干燥 真空干燥 冷冻干燥 粉碎技术： 超微粉碎技术,例: 采收加工技术对金银花质量影响,金银花（Flos Lonicerae） 忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥花蕾，是药食两用的大宗中药材。 成分 富含挥发油，绿原酸及其类似物等有机酸类，木犀草苷等黄酮类，神经酰胺类化合物，以及环烯醚萜及其苷类化合物等多种有效成分。 其制剂对金黄色葡萄球
6、菌、溶血性链球菌、肺炎双球菌等有明显抑制作用。,研究内容 以大白期金银花为材料，从金银花外观性状和游离氨基酸、可溶性糖、总黄酮、绿原酸等内在质量指标方面，以烘干、晒干、蒸后烘干方法为对照，对微波干燥、真空干燥、冷冻干燥等现代干燥技术的效果进行比较分析 利用超临界CO2萃取法和GC-MS分析比较晒干、微波干燥和冷冻干燥对挥发油化学组成的影响。 目的 筛选适于金银花规模化加工的干燥技术，为提高质控技术提供依据。,供试材料：忍冬花蕾 干燥方法 微波干燥、蒸后烘干、烘干、晒干、真空干燥、冷冻干燥 指标测定 浸出物量:参照药典 绿原酸含量:HPLC 总黄酮含量:Al(NO3)3-NaNO3比色法 可溶性
7、糖含量 :硫酸蒽酮法 游离氨基酸含量:茚三酮比色法 挥发油：GC-MS,不同干燥技术对金银花外观性状及化学成分含量产生了不同程度的影响。 微波干燥技术可作为规模化干燥加工金银花的重要方法。,微波干燥 蒸后干燥,晒干 烘干 真空干燥,例: 对花蕾化学成分的影响-不同干燥技术,绿原酸含量 蒸后烘干和微波干燥真空干燥冷冻干燥、烘干 总黄酮含量 蒸后烘干微波干燥和真空干燥其余处理。 游离氨基酸含量 真空干燥烘干处理冷冻干燥 可溶性糖含量 晒干和蒸后烘干处理微波干燥和烘干。 不同干燥技术对金银花有效成分和营养成分的影响是不同的。,原因： 微波干燥和蒸后烘干条件下使金银花鲜样在短时间内快速升温，多酚氧化酶
8、迅速失活，从而使这2种技术加工而成的金银花成品中绿原酸含量较高，而其它几种干燥技术都是缓慢升温，多酚氧化酶活性先增强而后再被灭活，使金银花中绿原酸被氧化，绿原酸分解损失较大，因而绿原酸含量相对较低。 冷冻干燥法对药材中的易氧化分解成分有保护作用，但实验中对冷冻干燥样品的有效成分和营养成分的含量分析却没有体现出冷冻干燥的优势。,二、天然产物传统提取技术 （一）溶剂提取法,定义：选用对所需成分溶解度大，而对其它成分溶解度小的溶剂，将所需的成分从植物组织内溶解出来。 基本原理 ：细胞渗透原理。 当溶剂加入到植物的原料中时，由于扩散、渗透等作用，溶剂逐渐通过细胞壁渗透到细胞之中，同时将细胞中所含的化学
9、成分逐渐溶解，使细胞内外产生浓度差。含有化学成分的浓溶液由于扩散又从细胞中透过细胞壁而到溶剂中。新的溶剂又不断进入，如此多次往返，最终细胞内外溶液浓度达到平衡。此时，若将溶液滤出，继续加入新溶剂并使这一过程重复进行，就可将有效成分大部分溶解出来。,环己烷，石油醚，苯，乙醚, 氯仿，乙酸乙酯，正丁醇，丙酮，乙醇，甲醇，水 极性： 亲脂性： 亲水性： 比水重的有机溶剂： 与水可以以任意比例混溶的有机溶剂： 与水分层的有机溶剂： 能与水分层的极性最大的有机溶剂： 常用来从水中萃取苷类、水溶性生物碱类成分的有机溶剂： 溶解范围最广的有机溶剂：乙醇 极性最小的有机溶剂：环己烷 极性最大的有机溶剂：甲醇,
10、3.溶剂选择的理论依据：“相似相溶”原则。,亲水性：这种近于水的性质。 亲脂性：近于油的性质。 各种溶剂都有一定程度的亲水性或亲脂性。 如乙醇的分子比较小，有羟基，与水的结构相似，所以能与水任意混溶。 丁醇和戊醇分子中都有羟基，保持与水近似的性质，但分子逐渐变大，与水的性质逐渐疏远，所以它们虽然能溶解在水里，但这种相互溶解却有一定的限度。在它们互溶达到保和状态以后，丁醇与戊醇即与水分层。 丙酮的分子也比较小，分子中的羰基是一个极性集团，所以丙酮的亲水性强，与水能完全互溶。,乙醚和乙酸乙酯的性质，与乙醇比起来区别就大一些。一方面分子量增大，但增大的并不太多；另一方面醚键和酯键都和油脂相近，所以它
11、们基本上属于亲脂性的溶剂，只是由于分子量不算太大，分子中虽然没有羟基，但仍有氧，仍然保持了一定程度的亲水性。 氯仿、苯和石油醚都是烃类和氯烃衍生物，分子中根本没有氧，而且分子量比较大，所以它们和油脂的性质相似，属于亲脂性溶剂。 植物中的有效成分（天然产物）在溶液中的溶解度与其化学结构、性质及溶剂的性质有很大的关系。,溶解度,化学性质稳定,安全、价廉,4. 溶剂的选择条件：,- 溶剂对所需成分溶解度大，对杂质溶解度小。 与植物中化学成分不起化学反应。 溶剂要经济易得，可回收，使用安全，不污染环境。,5. 常用提取溶剂 分为：水、亲水性和亲脂性有机溶剂。 常用溶剂极性：由弱到强依次排序为 石油醚四
12、氯化碳苯二氯甲烷氯仿乙醚乙酸乙酯正丁醇丙酮乙醇甲醇水, 水：强极性溶剂。,植物材料中的无机盐、(分子量不太大的)糖类、鞣质、氨基酸、蛋白质、有机酸盐、生物碱盐及甙类等均可被水溶出。 酸水性有利于提取生物碱；碱性水有利于溶出有机酸、黄酮、蒽醌、内酯、酚类等。,水作溶剂的主要缺点： 易霉变 由于水提取液中常含有糖类、蛋白质、氨基酸等物质，有利于微生物的生长，故易发生霉变。因此，若提取时间较长时，应加入少量防腐剂（如甲苯、甲醛、氯仿等）防腐。 难以过滤 果胶及粘液质、淀粉类物质的存在使水提液难以过滤，可加入助滤剂如1%2%的经过110活化1小时的热滑石粉或硅藻土（使胶质分散）等，进行减压过滤。,-易
13、提取不完全 次生物质有许多为亲脂性成分，溶解度小，不易提取完全。 -杂质较多 -难浓缩 当水提取液中含有皂甙及其粘液质类成分时，减压浓缩会产生大量泡沫，造成浓缩困难，在实验室中，可在水提液中加入少量丁醇或戊醇以防止泡沫产生；也可采用旋转蒸发器、薄膜浓缩法、喷雾干燥法等加快浓缩速度；对于蛋白质等不稳定物质，可采用冰冻干燥法。,助溶现象（增溶现象） 在提取有效成分时，提取液中存在着复杂的混合物，其中各成分互相影响，有时就会产生增溶现象，增大了欲提取物的溶解度。但是有时又可能由于化合物的相互作用生成了一些难溶解的化合物，改变了所要提取的化合物的溶解性而使其提取不出来。,亲水性有机溶剂,如乙醇、甲醇、
14、丙酮等能与水混溶的有机溶剂。 乙醇最常用，溶解性能好，对细胞穿透能力较强。 亲水性成分除蛋白质、粘液、果胶、淀粉和部分 多糖外，大多能在乙醇中溶解。 难溶于水的亲脂性成分，在乙醇中溶解度也较大。,不同浓度的乙醇对各种化学成分的溶解度不同。 如 2030的乙醇可溶解生物碱盐和蒽醌； 4050的乙醇可溶解强心甙和鞣质； 60%70的乙醇适用于甙类的提取； 95的乙醇则是提取叶绿素、挥发油等的良 好溶剂。 总之，乙醇的浓度越大，则溶解亲脂性成分越多；乙醇的浓度越小，则溶解亲水性成分越多。,用乙醇作提取溶剂的优、缺点：,提取时间短、溶出杂质（蛋白质、多糖）少。 提取液不易发霉变质。 乙醇挥发性大，浓缩
15、容易，用量小，且大部分可回收再用。 价廉，毒性小、来源方便。 缺点：易燃、损失较大,亲脂性有机溶剂,如石油醚、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯等不与水混溶的有机溶剂。 它们可以提取植物中的亲脂性成分，如油脂、挥发油、叶绿素、树脂、植物甾醇、内酯、某些生物碱及苷元（如甾体苷元、黄酮、蒽醌等）。,石油醚油脂、蜡、叶绿素、挥发油、游离甾体及三萜类化合物。 氯仿或醋酸乙酯游离生物碱、有机酸及黄酮、香豆素的苷元。,优点 沸点低，浓缩回收方便，选择性强，容易得到纯品。 缺点 挥发性大，多易燃有毒，价格昂贵。 透入植物组织能力较弱，提取时间长。若植物材料中含有较多水分，就很难溶出次生物质。因此，直接应用这类溶剂提取
16、有一定的局限性。,6. 提取方式,浸渍法 （冷浸）,煎煮法 （热提）,回流法 （有机溶剂）,连续提取法,渗漉法 （连续冷浸）,浸渍法：冷浸或温浸，常用水或乙醇，每次浸泡日，浸泡次。 本法操作简便，适宜于遇 热不稳定易分解或破坏的成分 的提取。但此法提取时间长， 溶剂用量大，提取效率不高。,6. 提取方式,渗漉法：将植物材料粉末加入适量浸出溶剂润湿，装入渗漉筒内，压实后，在上端不断添加溶剂，使之渗过材料，溶出的可溶性成分即从下口流出。优点是提取效率高，但提取费时，提取液体积太大，浓缩困难。 有渗漉筒和渗漉罐两种。 渗漉法适用于提取热敏性、挥发性或剧毒类成分和有效成份含量较低或要求浸出液浓度较高的物料,不宜用于黏性的不易流动的物料。,实验室常用仪器：渗漉筒；分液漏斗；粗色谱柱等。 操作步骤： 粉碎润湿拌匀静置 （30min） 装料压实添加溶剂静置（6h）渗
