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1、功能基因组学及其研究方法,基因组(genome)是德国遗传学家H. Winkler在1920年将gene（基因）和chromosome(染色体)两个词缩合而创造的一个新词，意思是指染色体上的全部基因。几十年来，随着分子生物学的发展，其含义扩展为在个体水平代表一个个体所有遗传性状的总和，在细胞水平代表一个细胞所有不同染色体（单倍体）的总和，在分子水平代表一个物种所有DNA分子的总和。,一、基因组学概念,基因组学（genomics）,研究生物基因组的结构和功能的科学，即从整体水平上来研究一个物种的基因组的结构、功能及调控的一门科学。 1986年提出，至今20年，已经发展成为遗传学中最重要的分支学科
2、。,基因组学研究的最终目标,获得生物体全部基因组序列; 鉴定所有基因的功能; 明确基因之间的相互作用关系; 阐明基因组的进化规律.,基因组学包括2-3个亚领域,亚领域 内容 结构基因组学 整个基因组的遗传制图、物理 制图、DNA测序； 功能基因组学 认识、分析整个基因组所包含 的基因、非基因序列及其功能； 蛋白质组学 研究细胞内蛋白质的组成及其活 动规律。,结构基因组学,结构基因组学，顾名思义，就是研究生物基因组结构的科学。它是基因组研究的第一阶段的工作，建立功能基因组学的基础。其主要目标是绘制生物的遗传图（genetic map）、物理图（physical map）、转录图（transcri
3、pt map）和序列图（sequence map）。 基因组测序是结构基因组学最基本的研究工作。 结构基因组学(structural genomics)是通过人类基因组计划(Human Genome Project, HGP) 的实施来完成的。,结构基因组学,HGP的内容就是制作高分辨率的人类遗传图和物理图，最终完成人类和其它重要模式生物全部基因组DNA序列测定。 自1990年开始实施人类基因组计划以来，在它的影响下，迄今已完成了400多个物种的基因组DNA序列的测定，其中包括流感嗜血杆菌、大肠杆菌、酵母、秀丽线虫等多个病原微生物和模式生物以及人类基因组的测序。,结构基因组学,模式生物是指一类
4、被深入研究旨在揭示特定生命现象普遍规律的生物物种。大多数生物学过程在长期的进化过程中是高度保守的，因此，许多生物学过程在大多数或所有的模式生物中都是类似的，模式生物也因此在生物学研究中具有不可替代的重要作用。,人类基因 组计划,基因定位 基因组作图 测定核苷酸序列,结构基因组学,The E.coli genome,A portion of the E.coli chromosome showing genes and operons. A dot indicates the promoter for each gene or operon. Arrows and color indicate
5、the direction of transcribtion: dark blue genes are transcribed left to right, light blue are transcribed right to left.Overlapping gene are shown in green.,功能基因组学,概念：利用结构基因组学提供的信息，以高通量，大规模实验方法及统计与计算机分析为特征，全面系统地分析全部基因的功能的学科。 近年来应用计算机生物信息技术，分析研究已测序完DNA序列的生物基因组后，发现了未知功能的许多基因，这促进了基因定位和基因表达调控的研究。 但目前功能基
6、因组学的研究，还只局限于RNA水平。今后随着蛋白质分析技术的发展，例如，高效和超高灵敏度的双向凝胶电泳、色谱仪的出现，人们有可能在蛋白质水平上，分析基因组中基因间的相互作用，进而进一步地丰富和发展功能基因组学。,主要具体内容包括以下方面 （一）鉴定DNA序列中的基因 （二）同源搜索预测基因功能 （三）实验性研究基因功能 （四）描述基因表达模式 （五）蛋白质相互作用的模式,（一）鉴定DNA序列中的基因 计算机对基因组序列(DNA序列)进行分析，包括鉴定和描述推测的基因、非基因序列及其功能。,根据序列分析搜寻基因,查找开放阅读框（open reading frame, ORF） 开放阅读框都有一个
7、起始密码子，ATG，还要有终止密码子。 从ATG开始，然后向下游寻找终止密码子。 起始密码子和终止密码子之间的碱基数目要能够被3整除 每一条链都有3种可能的阅读框，2条连共计有6种可能的阅读框.,（二）同源搜索设计基因功能 同源基因在进化中来自共同的祖先，通过核苷酸序列或氨基酸序列的同源性比较推测基因组内相似功能的基因。,同源基因 起源于同一个祖先，在不同的物种中结构和功能相同或相似的基因。,同源查询的依据,有亲缘关系的物种，基因组可能存在某种程度的相似性： 存在某些完全相同的序列； ORF演绎的氨基酸序列相似； ORF的排列相似，如等长的外显子； 模拟的多肽链的高级结构相似，等。,生物信息学
8、(bioinformatics),是运用计算机技术和信息技术开发新的算法和统计方法，对生物实验数据进行分析，确定数据所含有的生物学意义，并开发新的数据分析工具以实现对各种信息的获取和管理的学科。 利用生物信息学能够分析从微生物、动物、植物以及人类基因组序列测定产生的大量资料，阐明遗传信息。 研究内容两大类：DNA 数据分析； 蛋白质数据分析。,DNA序列分析 基因结构域分析，包括启动子、转录因子结合序列、内含子、外显子、重复序列、开放读码框架等。 同源分析和检索，包括DNA数据库、EST数据库、STS数据库、Unigene数据库、Swissprot数据库等。,蛋白质的数据分析 蛋白质一级结构分
9、析： 结构特点分析，包括等电点、信号肽、穿膜区、DNA结合序列等同源分析和检索，包括Nr数据库、Swissprot 数据库等功能区分析，包括Prosite、Emotif、Identify分析等。 蛋白质空间结构分析： 蛋白质晶体结构数据库检索，如PDB数据库。蛋白质空间结构预测，如Homology等软件分析。,（三）实验性研究基因功能 基因克隆 基因敲除（knock-out） 转座子插入突变 基因的超表达 反义RNA技术 RNAi,基因克隆的策略,基因文库传统方法 PCR 扩增 后基因组时代,基因敲除技术（gene knockout) 通过基因工程的方法将一个结构已知但功能未知的基因去除，或用
10、其他序列相近的基因取代（又称基因敲入,基因替换），然后从整体观察生物体，从而推测相应基因的功能。这种人为地把生物体某一种有功能的基因完全缺失的技术称为基因敲除技术。,基因替换 转座子诱变 整合突变 自杀质粒介导的缺失突变,（四）描述基因表达模式 采用DNA微点阵进行整体基因表达谱-转录组分析； 采用蛋白质或多肽微点阵、改进的双向电泳结合飞行质谱技术分析蛋白质表达谱-蛋白质组分析。,转录组(transcriptome): 一个细胞内的一套mRNA转录物，包含了某一环境条件、某一生命阶段、某一生理或病理(功能)状态下，生命体的细胞或组织所表达的基因种类和水平。,转录组学的研究方法DNA芯片技术,基
11、因表达谱类型: 1，组织、细胞表达谱 2，差异的组织、细胞表达谱 3，诱导的细胞表达谱表达谱 专用技术: 1，SAGE分析 2，生物芯片技术(基因芯片，细胞芯片，组织芯片) 3，其它,Serial Analysis of Gene Expression (SAGE)用于定量地、平行地分析大量的转录本。若要知道一种组织，器官或细胞的基因表达谱，首先从组织细胞里分离出短的诊断性Tags ，归类并克隆。测定数千个克隆的DNA序列就可以了解代表这种组织、器官或细胞的功能的基因表达谱。所以SAGE提供了一种广泛应用的工具，定量地分析比较各种正常组织细胞，各种发育状态和各种病理状态下的基因表达谱。http
12、:/www.sagenet.org/网站搜集了大量的SAGE供研究者检索。,Serial Analysis of Gene Expression (SAGE),Sequencing thausands tags,Liver,cDNA Express sequence tag,cloning,Determining a gene expression pattern characteristic of livers function,mRNA,基因芯片技术,信息时代的产物90年代兴起的一项前沿 生物技术 横跨： 生命科学、 物理学、 计算机科学、微电子技术 光电技术、 材料科学 等现代高科技,高
13、度集约化 高灵敏度 大通量平行分析,DNA微列阵(DNA microarrays)是利用DNA芯片技术，同时进行大量分子杂交，以分析比较不同组织或器官的基因表达水平，筛选突变基因，从核酸水平分析基因表达模式。是后基因组学研究中的重要方法之一。,基因芯片发展历史,Southern & Northern Blot,Dot Blot,Macroarray,Microarray,其基本原理是将一系列的核酸片段固定在芯片载体上作为固相靶片段（target）， 待测的核酸片段人工标记上不同的荧光、或同位素等作为探针（probe），一定条件下两者杂交，根据杂交后不同的信号即可获得靶片段的信息，进行计算机分析
14、。,制备靶片段,结果观察，信息分析,杂交,扫描图,蛋白质组(proteom)： 一个细胞内的全套蛋白质，反映了特殊阶段、环境、状态下细胞或组织在翻译水平的蛋白质的表达谱。 基因是遗传信息的携带者,而全部生物功能的执行者却是蛋白质, 仅仅从基因的角度来研究是远远不够的。,蛋白质组学(proteomics) 研究细胞内蛋白质组成及其活动规律。旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式,内容包括鉴定蛋白质表达、存在方式、结构、功能和相互作用方式等。,蛋白质组学比基因组学更为复杂：DNA线状结构与二级结构的功能差异不大，但多肽链需折叠成一定的三维空间结构才形成有功能的蛋白质；同一种蛋白质经不同的加工
15、修饰可形成不同的功能，因此蛋白质的多样性远复杂于基因本身。,蛋白质组学的研究方法 双向电泳（two dimension electrophoresis,2-DE）： 蛋白质具有等电点和分子量的特异性，将蛋白质混合物在电荷（等电聚焦，IEF）和分子量（变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，SDS-PAGE）两个水平上进行分离。,生物质谱技术 Mass Spectrometry：,通过测定样品离子的质荷比（m/z）来进行成分和结构分析。,蛋白质2D电泳分析 A对照；B为人的垂体瘤蛋白质2D电泳箭头示有明显差异的蛋白质。,真核生物的基因表达受转录因子控制，转录因子需与启动子区域的DNA结合并激活RNA聚合酶转录。
16、,转录因子具有DNA结合及激活转录两功能，分别由不同区域完成，而且将这两部分分割成两个片段后仍由互作能装配成一个完全有功能的转录因子。,基于这一特点，设计出酵母双杂交系统。,是利用酵母菌同一个细胞中共同表达不同蛋白质，以鉴定蛋白质之间互作的一种分析方法。,酵母菌双杂交系统(two hybrid-systems) ：,蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成者。几乎所有的重要生命活动，包括DNA的复制与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。,蛋白质之间相互作用研究的重要性,酵母双杂交 各种亲和分析（亲和色谱、免疫共沉淀等） 荧光共振能量转换效应分析 噬菌体显示系统筛选等等,常用蛋白质相互作用的研究技术,一、酵母双杂交技术的基本原理,二、酵母双杂交系统的应用,（一）分析已知蛋白之间的相互作用 （二）对蛋白质功能域的分析 （三）分析未知蛋白相互作用 （四）绘制蛋白质相互作用系统图谱 （五）在药物设计中的应用,
