微生物的遗传变异与育种_1课件

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1、1,第九章 微生物的遗传变异 与育种,2,本章的学习目的与要求,掌握微生物基因突变、遗传育种的方法、基因重组、菌种衰退、复壮和菌种保藏的方法； 熟悉基因工程的基本操作步骤及未来的前景； 了解证明DNA(RNA)是遗传物质的三个经典实验。,3,本章的内容,第一节 遗传变异的物质基础 第二节 微生物的基因突变 第三节 微生物的基因重组 第四节 微生物与基因工程 第五节 微生物的菌种选育 第六节 微生物菌种的保藏与复壮,4,遗传与变异的概念,遗传和变异是生物体的最本质的属性之一。 遗传：亲代将自身一整套遗传因子传递给下一代的行为和功能。 “种瓜得瓜，种豆得豆” 变异：生物体的遗传物质结构和数量的改变

2、，在群体中以极低的几率（10-510-6）出现，性状变化幅度大；新性状稳定、可遗传。 “一母生九子，九子各不同”,5,遗传与变异的概念,遗传型（genotype）：一个生物体所含有的基因的总和。 表型（phenotype）：一个生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和。 饰变（modification）：指生物体由于非遗传因素引起的表型改变，变化发生在转录、转译水平，特点是几乎整个群体中的每一个个体都发生同样的变化，性状变化的幅度小，不遗传，引起饰变的因素消失后，表型即可恢复。,微生物是遗传学研究中的明星：,微生物细胞结构简单,营养体一般为单 倍体，方便建立纯系。,很多常见微生物都易于人工培

3、养,快速、 大量生长繁殖。,对环境因素的作用敏感,易于获得各类 突变株，操作性强。,微生物是研究现代遗传学和其它许多主要的生物学基本理论问题中最热衷的研究对象。 对微生物遗传规律的深入研究，不仅促进了现代分子生物学和生物工程学的发展，而且为育种工作提供了丰富的理论基础，促使育种工作从不自觉到自觉、从低效到高效、从随机到定向、从近缘杂交到远缘杂交的方向发展。,研究微生物遗传学的意义,8,第 一 节,微生物遗传变异的 物质基础,第一节 遗传变异的物质基础,种质连续理论：18831889年间Weissmann提出。认为遗传物质是一种具有特定分子结构的化合物。 基因学说：二十世纪初发现了染色体并提出基

4、因学说，使得遗传物质基础的范围缩小到染色体上。 染色体由核酸和蛋白质两种长链高分子组成。20多种氨基酸经过不同排列组合，可以演变出的蛋白质数目几乎可以达到一个天文数字，而核酸的组成却简单得多，一般仅由4种不同的核苷酸组成，它们通过排列组合只能产生较少种类的核酸，因此当时认为决定生物遗传型的染色体和基因，起活性成分是蛋白质。 DNA是遗传变异的物质基础的证明：1944年以后，利用微生物为实验对象进行的三个著名实验（肺炎球菌的转化试验、噬菌体感染试验、病毒的拆开与重建试验）,10,第一节 遗传变异的物质基础,三个经典实验 遗传物质在细胞内的存在部位和方式 朊病毒的发现与思考,1928年，Griff

5、ith进行了以下几组实验： （1）动物实验 对小鼠注射活R菌或死S菌 小鼠存活 对小鼠注射活S菌小鼠死亡 对小鼠注射活R菌和热死S菌 小鼠死亡 抽取心血分离活的S菌,一、三个经典实验,（一）经典转化实验（transformation）：F.Griffith， 研究对象：Streptococcus pneumoniae（肺炎双球菌） S型菌株：有致病性，菌落表面光滑，有荚膜 R型菌株：无致病性，菌落表面粗糙，无荚膜,（2）细菌培养实验 热死S菌不生长 活R 菌长出R菌 热死S菌+活R 菌长出大量R菌和10-6S菌,（3）S型菌的无细胞抽提液试验 活R菌+S菌无细胞抽提液长出大量R菌和少量S菌,以

6、上实验说明：加热杀死的S型细菌细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入R型细胞并使R型细胞获得稳定的遗传性状。,加S菌DNA 加S菌DNA及DNA酶以 外的酶 加S菌的DNA和DNA酶 加S菌的RNA 加S菌的蛋白质 加S菌的荚膜多糖,活R菌,长出S菌,只有R菌,1944年O.T.Avery、C.M.MacLeod和M。McCarty从热死S型S. pneumoniae中提纯了可能作为转化因子的各种成分，在离体条件下进行了转化试验：,只有S型细菌的DNA才能将S. Pneumoniae的R型转化为S型。且DNA纯度越高，转化效率也越高。说明S型菌株转移给R型菌株的，是遗传因子。,（二）

7、噬菌体感染实验,A. D. Hershey和M. Chase， 1952年,（1）含32P-DNA的一组：放射性85%在沉淀中 （2）含35S-蛋白质的一组：放射性15%在上清液中 所以，进入细胞的是噬菌体的核酸而不是蛋白质。,（三）植物病毒的重建实验,为了证明核酸是遗传物质，H. Fraenkel-Conrat（1956）用含RNA的烟草花叶病毒（TMV）进行了著名的植物病毒重建实验。 将TMV在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能将其蛋白质外壳与RNA核心相分离。分离后的RNA在没有蛋白质包裹的情况下，也能感染烟草并使其患典型症状，而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子。,选用TMV和霍氏车前花叶病

8、毒（HRV），分别拆分取得各自的RNA和蛋白质，将两种RNA分别与对方的蛋白质外壳重建形成两种杂合病毒： （1）RNA（TMV） 蛋白质（HRV） （2）RNA（HRV） 蛋白质（TMV） 用两种杂合病毒感染寄主： （1）表现TMV的典型症状病分离到正常TMV粒子 （2）表现HRV的典型症状病分离到正常HRV粒子。 上述结果说明，在RNA病毒中，遗传的物质基础也是核酸。,二、朊病毒的发现与思考,朊病毒含有微量的核酸，仍未发现？ 朊病毒仅由蛋白质构成 朊病毒的遗传物质为蛋白质？,二、朊病毒的发现与思考,(参见 P191 和 P195),亚病毒的一种:具有传染性的蛋白质致 病因子,迄今为止尚为发现

9、该蛋白内含 有核酸。,其致病作用是因动物体内正常的蛋白 质PrP c改变折叠状态为PrP sc所致,而 这二种蛋白质的一级结构并没有改变.,人的库鲁病(kuru)、克雅氏病 (Creutzfeldt Jakob disease, CJD)等,羊搔痒症(scrapie),牛海绵状脑病 (spongiform encephalopathy),引起人与动物的致死 性中枢神经系统疾病,Prusiner (1982)提出羊搔痒病因子是一种蛋白 质侵染颗粒(proteinaceous infectious particle), 并将之称做Prion或Virino。-朊病毒,1997年，Stanley B.

10、 Prusiner荣获诺贝尔奖,二、朊病毒的发现与思考,1）蛋白质是否可以作为遗传物质？ prion是生命的一个特例？ 还是仅仅为表达调控的一种形式？,2）蛋白质折叠与功能的关系,是否存在折 叠密码？,DNARNA肽链蛋白质,三、遗传物质在细胞内的存在部位和方式,核酸存在的七个水平 细胞水平： 存在于细胞核或核质体 细胞核水平： 单核或多核结构 染色体水平： 倍性(真核)和染色体数 核酸水平：在原核中同染色体水平、存在部分二倍体 DNA或RNA，复合或裸露，双链或单链 基因水平：一切具有自主复制能力的遗传功能单位均可称为基因。 1000bp大小， 分子量约6.7105Dalton 密码子水平：

11、 第三位模糊,起始和终止,信息单位 核苷酸水平： 突变或交换单位,24,第 二 节,微生物的基因突变,25,主要内容,一、突变类型 二、常见的微生物突变类型 三、诱变剂与致癌物质Ames试验 四、基因突变的特点 五、基因突变的机制 六、DNA损伤及其修复,突变(mutation) 指遗传物质核酸（DNA或RNA病毒中的RNA）中的核苷酸顺序突然产生了稳定的可遗传的变化。,一、突变类型,突变,基因突变,染色体畸变,由于DNA链上的一对或少数几对碱基发生改变而引起的。,DNA的大段变化（损伤）现象，表现为染色体的添加（插入、缺失、重复、易位和倒位）,按突变涉及的范围，突变可以分为基因突变和染色体畸

12、变。,突变,自发突变,诱发突变,环境因素的影响,DNA 复制过程的偶然错误等 而导致,一般频率较低, 通常为10-6-10-9 。,某些物理、化学因素对生 物体的DNA进行直接作用， 突变以较高的频率产生。,按突变的条件和原因划分，突变可以分为自发突变和诱发突变。,29,突变类型,按突变所带来的表型改变，突变的类型可以分为形态突变型、致死突变型、条件突变型、营养缺陷型、抗性突变型、抗原突变型等。,二、常见的微生物突变类型,（参见 P 207-209）,表型,基因型,这里主要介绍几种常用的由于基因突变而造成微生物表型变化的突变型及 其分离,第二节 微生物的基因突变,二、常见的微生物突变类型,(参

13、见 P 207-209),1）营养缺陷型(auxotroph),一种缺乏合成其生存所必须的营养物 (包括氨基酸、维生素、碱基等)的突变型, 只有从周围环境或培养基中获得这些营养 或其前体物(precursor)才能生长。,营养缺陷型是微生物遗传学研究中重 要的选择标记和育种的重要手段,判断表型的标准:,在基本培养基上能否生长.,二、常见的微生物突变类型,（参见 P 207-209）,1）营养缺陷型(auxotroph),特点：,在选择培养基(常为基本培养基)上不生长,负选择标记,突变株不能通过选择平板直接获得,1）营养缺陷型(auxotroph),实验步骤见 P 208,影印平板(Replic

14、a plating)法 是Lederberg夫妇在1952年建立,二、常见的微生物突变类型,营养缺陷型的表示方法：,1)营养缺陷型(auxotroph),基因型:,所需营养物的前三个英文小写斜 体字母表示:hisC(组氨酸缺陷型,其中的大写 字母C同一表型中不同基因的突变）,表型:,同上, 第一个字母大写,且不用斜体： HisC.,在具体使用时多用hisC-和hisC+,分别表示缺 陷型和野生型。,二、常见的微生物突变类型,参见 P 207-209,2）抗药性突变型(resistant mutant),基因突变使菌株对某种或某几种药物,特 别是抗生素，产生抗性。,特点:,正选择标记(突变株可直

15、接从抗性平板 上获得-在加有相应抗生素的平板上,只有抗 性突变能生长。所以很容易分离得到。),表示方法:,所抗药物的前三个小写斜体英文 字母加上“r”表示strr 和 strs 分别表示对链霉素 的抗性和敏感性。,二、常见的微生物突变类型,（参见 P 207-209）,3)条件致死突变型(conditional lethal mutant),在某一条件下具有致死效应,而在另一条件 下没有致死效应的突变型。,常用的条件致死突变是温度敏感突变,用ts (temperature sensitive)表示,这类突变在高温 下(如42)是致死的,但可以在低温(如25-30) 下得到这种突变。,特点:,负

16、选择标记,这类突变型常被用来分离生长繁殖必需的突变基因,二、常见的微生物突变类型,4)形态突变型(morphological mutant),造成形态改变的突变型,特点：,非选择性突变 突变株和野生型菌株均可生长,但 可从形态特征上进行区分。,举例：,产蛋白酶缺陷突变株的筛选,菌落颜色变化,半乳糖苷酶基因的插入失活,使重组 子菌落为白色与兰色的非重组子分开.,形成芽孢缺陷菌株,细胞水平上的形态突变,突变株的检出 更加困难。,二、常见的微生物突变类型,（参见 P 207-209）,5）其它突变类型,毒力、生产某种代谢产物的发酵能力 的变化等在实际应用中具有重要意义突 变类型一般都不具有很明显或可直接检 测到的表型。其突变株的获得往往需要 较大的工作量。,三、诱变剂与致癌物质Ames试验,（参见 P 212）,a)利用各种诱变剂获得各类遗传突变， 进行诱变育种；,c)危害人类自身的