微生物遗传变异 (2)课件

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1、第 七 章 微生物的遗传变异和育种,遗传：,亲代与子代相似,变异：,亲代与子代、子代间不同个体不完全相同,遗传（inheritance）和变异（variation）是生命的最本质特性之一,遗传型：,表型：,生物的全部遗传因子所携带的遗传信息,具有一定遗传型的个体，在特定环境条件下通过生长发育所表现出来的外表特征和内在特征的总和。,表型是由遗传型所决定，但也和环境有关。,表型饰变：,表型的差异只与环境有关 特点：暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为,遗传型变异（基因变异、基因突变）：,遗传物质改变，导致表型改变 特点：遗传性、群体中极少数个体的行为（自发突变频率通常为10-6-10-9）,粘

2、质沙雷氏菌 25C的斜面培养基； 37C的斜面培养基； 25C的液体培养基； 37C的液体培养基.,第一节 遗传变异的物质基础,一、三个证明DNA是遗传物质的经典实验 （一） 经典转化实验 肺炎链球菌： S型（菌体具荚膜，菌落表面光滑，有 致病能力） R型（菌体无荚膜，菌落表面粗糙，无 致病能力）,小鼠注入活的S型菌株，小鼠死亡，说明S型菌株有致病性。,1928年，F.Griffth作了3组实验:,1、动物试验,小鼠注入活的R型菌株，小鼠存活，说明R型菌株不具有致病性。,小鼠注入热致死的S型菌株，小鼠存活，说明热致死的S型菌株不具有致病性。,说明R型菌株和S型菌株之间有转化现象。,小鼠注入活的

3、R型菌株和热致死的S型菌株，小鼠死亡。,实验证明，R菌和S菌之间有转化现象,2、细菌培养实验,3、S型菌的无细胞抽提液试验,以上实验说明：加热杀死的S型细菌细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入R型细胞使其转变为S型细胞。,热死S菌不生长 活 R菌长出R菌 热死S菌+活R菌长出大量R菌和10-6S菌,活R菌+S菌无细胞抽提液长出大量R菌和少量S菌,平皿培养,肺炎链球菌,1944年，Avery精确重复了转化实验，确定了转化因子,实验证明，将R菌转化为S菌的转化因子是DNA,加S菌DNA 加S菌DNA及DNA酶以外的酶 加S菌的DNA和DNA酶 加S菌的RNA 加S菌的蛋白质 加S菌的荚

4、膜多糖,活R菌,长出S菌,只有R菌,只有S型细菌的DNA才能将R型转化为S型,（二）噬菌体感染实验（A. D. Hershey和M. Chase）,以32P标记核酸做噬菌体感染实验,（1）含32P-DNA的一组：放射性85%在沉淀中,上清液中含 15%放射性,沉淀中含 85%放射性,沉淀中含 25%放射性,以35S标记蛋白质外壳做噬菌体感染实验,（2）含35S-蛋白质的一组：放射性75%在上清液中,上清液中含 75%放射性,证明遗传物质是DNA而不是蛋白质,（三）植物病毒重建实验,实验证明，在RNA病毒中遗传物质是RNA,通过三个具有历史意义的经典试验证明：只有核酸才是负载遗传信息的真正物质。

5、,二、遗传物质在微生物细胞内存在的部位和方式 （一）遗传物质在7个水平上的形式 1、细胞水平 2、细胞核水平 3、染色体水平 4、核酸水平 5、基因水平 6、密码子水平 7、核苷酸水平,（二）原核生物的质粒,1、定义 质粒（plasmid）：凡游离于原核生物核基因组以外，具有独立复制的能力的小型共价闭合环状的dsDNA分子。 质粒所含的基因对宿主细胞一般是非必需的； 在某些特殊条件下，质粒有时能赋予宿主细胞以特殊的机能，从而使宿主得到生长优势。,2、结构特点 通常以共价闭合环状简称CCC)的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中； 质粒分子的大小范围从1kb左右到1000kb； （细菌质粒多在10k

6、b以内）,1 SC构型:共价闭合环形DNA（cccDNA) 2 OC构型:开环DNA（ocDNA) 3 L构型:线形分子（LDNA）,质粒DNA分子具有三种不同的构型：,在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒DNA，电泳迁移速度不同。 超螺旋线形开环,3、质粒的类型,严谨型质粒(stringent plasmid)：复制行为与核染色体的复制同步，低拷贝数 松弛型质粒(relaxed plasmid)：复制行为与核染色体的复制不同步，高拷贝数,窄宿主范围质粒(narrow host range plasmid) （只能在一种特定的宿主细胞中复制）,广宿主范围质粒(broad host rang

7、e plasmid) （可以在许多种细菌中复制）,4、质粒在基因工程中的应用 质粒的优点： （1）相对分子量小，易分离和操作 （2）环状，稳定 （3）独立复制 （4）拷贝数多 （5）存在标记位点，易筛选,E. coli的pBR322质粒,5、质粒的检测,提取所有胞内DNA后电镜观察；,超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察；,对于实验室常用菌，可用质粒所带的某些特点， 如抗药性初步判断。,6、质粒的主要种类,质粒所编码 的功能和赋 予宿主的表 型效应,致育因子（Fertility factor，F因子） 抗性因子（Resistance factor，R因子） Col质粒（colicin plasmid

8、） Ti质粒（tumor inducing plasmid） Ri质粒（rot inducing plasmid） 降解性质粒（degradative plasmid) Mega质粒（mega plasmid）,第二节 基因突变和诱变育种,一、基因突变 指细胞内（或病毒粒内）遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化，可自发或诱导产生。,基因突变,狭义：点突变 广义：基因突变和染色体畸变,野生型（原始性状）,基因突变,突变型（新性状）,（一）突变类型,1、根据突变的原因分为,自发突变,诱发突变,2、根据突变株的 表型分为,营养缺陷型,抗性突变型,条件致死突变型,选择性突变株,非选择性突变株

9、,形态突变型,抗原突变型,产量突变型,（二）突变率 某一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。 （三）基因突变的特点 1、自发性 2、不对应性 3、稀有性 4、独立性 5、可诱变性 6、稳定性 7、可逆性,（四）基因突变及其机制,基因突变,自发突变,诱发突变,点突变,转换：AG T C,颠换：A T A C G C C T,碱基置换,移码突变,缺失：ABC ABABCA,添加: ABC ABCABCA,染色体畸变,缺失:abc ghijkl,添加,重复:abc abc def 插入:abc pqr def,易位（转座）abc pqr ghi.,倒位:abc fed ghi.,1、诱发突变：是

10、通过人为的方法,利用物理、化学和生物的因素显著提高突变频率的作法. （1）碱基的置换,包括转换和颠换,碱基的置换引起的突变,同义突变 ：密码子虽然改变，然而所编码的氨基酸还是原来的氨基酸，那么这一密码子称为同义密码子，这样的突变为同义突变或沉默突变。它对该蛋白质的功能没有影响.,无义突变：由于某一碱基的替换，使原来编码某一氨基酸的密码子突变成为终止密码子UAA、UGA、UAG中的一种，致使肽键的合成提前终止，肽键缩短，成为没有活性的多肽片段。,错义突变：在基因中由于碱基对的替换，使mRNA分子中编码某一氨基酸的密码子变成编码另一氨基酸的密码子。,酪氨酸,酪氨酸,天冬氨酸,（2）移码突变：指诱变

11、剂会使DNA序列中的一个或少数几个核苷酸发生增添（插入），从而使该处后面的全部遗传密码的阅读框架发生改变，并进一步引起转录和翻译错误的一类突变。,（3）染色体畸变：某些强烈理化因子（电离辐射和烷化剂、亚硝酸）等引起的DNA分子的大损伤。 包括:缺失、重复、插入、易位、倒位,2、自发突变：是指生物体在无人为干预下自然发生的低频率突变. 原因： （1）背景辐射和环境因素 （2）有害产物积累 （3）碱基错配 （4）由转座子引起的插入或缺失,（五）紫外线对DNA的损伤及其修复,嘧啶,嘧啶二聚体,UV,1、光复活作用,嘧啶二聚体,嘧啶,光解酶,黑暗,光照,2、切除修复,1、由核酸内切酶切开二聚体的5末端

12、，形成3-OH和5-P的单链缺口 2、核酸外切酶从5-P到3-OH方向切除二聚体，并扩大缺口。 3、DNA聚合酶以另一条互补链为模板，从原有链上暴露的3-OH端起合成缺失片段。 4、连接酶将新合成的3-OH与原有的5-P相连接。,3、重组修复,这是一种越过损伤而进行的修复，通过复制后，经染色体减缓，使子链上的空隙并不为不再对着嘧啶二聚体，而是面对正常的单链，在这种情况下，DNA聚合酶和连接酶便能起作用，把空隙部分进行修复。,4、SOS修复,是一种旁路系统，它允许新生的DNA链越过嘧啶二聚体而生长。,二、突变与育种 （一）自发突变与育种： 从生产中选育 定向培育优良菌株 （二）诱变育种 1、诱变

13、育种的基本环节,2、诱变育种的原则 （1）使用简便有效的诱变剂,诱变剂,物理因素,化学因素,紫外线 激光 离子束 X射线 r射线 快中子,烷化剂（NTG） 碱基类似物 吖啶化合物,（2）选用优良的出发菌株 （3）处理单细胞或单孢子悬浮液 （4）使用最佳诱变剂量 （5）充分利用复合处理协同效应 （6）利用和创造形态、生理与产量间的相关指标 （7）设计高效率筛选方案 （8）创造新型、高效筛选方法,3、诱变育种的基本过程：,选择合适的出发菌株 制备待处理的菌悬液 诱变处理 筛选 保藏和扩大试验,出发菌株的选择：,出发菌株用来育种处理的起始菌株, 出发菌株应具备： 对诱变剂的敏感性高； 具有特定生产性

14、状的能力或潜力；, 出发菌株的来源； 自然界直接分离到的野生型菌株： 历经生产考验的菌株： 已经历多次育种处理的菌株：,2）制备细胞悬液,要求： 菌体处于对数生长期，并使细胞处于同步生长； 细胞分散且为单细胞,方法： 玻璃珠打散10-15min; 加.3%吐温80（表面活性剂） 用无菌脱脂棉过滤。,制备： 物理诱变剂生理盐水（0.85%NaCl) 化学诱变剂缓冲液,浓度： 细菌、放线菌 108个/ml 霉菌、酵母菌 106个/ml,诱变处理： 诱变剂的作用： 提高突变的频率 扩大产量变异的幅度 使产量变异朝着正突变或负突变移动 选择诱变剂的种类：在选用理化因子作诱变剂时，在同样效果下，应选用最

15、方便的因素；而在同样方便的情况下，则应选择最高效的因素。在物理诱变剂中，尤以紫外线为最方便，而在化学诱变剂中，一般可选用诱变效果最为显著的“超诱变剂”，如NTG。,菌种筛选,实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。 初筛的目的：删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良性状的菌株不至于漏网；因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次；初筛手段应尽可能快速、简单。 复筛的目的：确认符合要求的菌株；复筛以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标。,筛选是最为艰难的也是最为重要的步骤.,定义：两个独立基因组内的遗传基因，通过一定的途经转移在一起，形成新的稳定基因组的过程称为基因重组或遗传重组。 作用：重组可使生物体在未发生突变的情况下，也能产生新遗传型的个体。,第三节 基因重组和杂交育种,一、原核生物的基因重组 （一）转化 受体菌直接摄取供体菌的DNA片段，而获得后者部分遗传性状的的现象，称为转化。,供体菌,受体菌,DNA片段,1928年，Griffith发现肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）的转化现象,目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力,1、建立了感受态的受体细胞 感受态细胞：具有摄取外源DNA能力的细胞 自然感受态的出现是细胞一定生长阶段的生理特性，受细菌 自身的基因控制； 人工感受