微生物菌种课件

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1、第二章 微生物菌种选育,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,发酵工程工业生产水平的三个决定要素,生产菌种的性能 发酵和提取工艺条件 生产设备,获得优良的生产菌种是实现高水平微生物工程工业生产的第一环节.,第一节 菌种来源,工业发酵常见微生物种类 发酵工业上常见的微生物有细菌、酵母、霉菌和放线菌。,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,细菌,醋酸杆菌（Acetobacter） ，用于生产醋酸和维生素C。 假单胞菌(Pseudomonas)，荧光假单胞菌发酵生产2-酮基D-葡萄糖酸。 乳酸菌（Lactobacillus） ，发酵生产乳酸。 大肠杆菌（E. coli），生

2、产谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶、天冬氨酸、苏氨酸和缬氨酸。 枯草芽孢杆菌生产淀粉酶、蛋白酶和某些氨基酸、肌苷、5-肌苷酶等。 梭状芽孢杆菌生产丙酮-丁醇。 北京棒杆菌生产谷氨酸。,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,酵母菌,酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：发面和酿酒及分子生物学用。 假丝酵母属（Candida）：生产SCP。 汉逊氏酵母属：产乙酸乙酯。 毕赤酵母属（Pichia）：工业污染菌。,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,霉菌,曲霉属（Aspergillus）：黑曲霉（A. niger）生产柠檬酸、草酸、葡萄糖酸、糖化酶、酸性蛋白酶、果胶酶、单宁酶等；米曲霉（A.

3、 oryzae）用于酿酒和L-乳酸生产。 青霉属（Penicillum），生产青霉素，桔青霉（P. citrinum）可产生5磷酸二酯酶，降解核糖核酸为四个单核苷酸。 根霉属（Rhizopus ）用于米酒和黄酒生产， 还用于淀粉糖化菌、有机酸发酵及甾体转化。 毛霉（Mucor）产生蛋白酶，生产腐乳、酱 油，进行甾体转化。,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,放线菌,最大的经济价值在于产生多种抗生素 链霉菌（Streptomyces）,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,放线菌（链霉素四环素；红霉素等）,真菌（青霉素、头孢等）,一些产芽孢的细菌,植物或动物来源,食用菌和藻类,发酵工程 第二章 微生物

4、菌种选育,工业微生物来源,想菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。 从自然界采集分离。 从一些发酵制品中分离目的菌株。,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,微生物菌种的选择性分离,工业化菌种的要求 能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物； 有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操作性要强； 遗传性能要相对稳定； 不易感染它种微生物或噬菌体； 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病 菌无关）； 生产特性要符合工艺要求。,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,菌种分离的一般过程,土样的采取, 富集, 分离, 目的菌的筛选,如何使样品中所含微生物的可能性大,如

5、何在后续的操作中使这种可能性实现,目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物,问题：,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,调查研究（包括资料查阅）,筛 选 工 作 程 序,分离与筛选的设计要求,在筛选所需菌株时应考虑以下一些重要指标：,1、菌的营养特征,一般要求采用廉价的培养基或使用来源丰富的原料,2、菌的生长温度,3、菌的稳定性,4、菌的产物得率和产物在培养液中的浓度,5、菌对所采用的设备和生产过程的适应性,6、容易从培养液中回收产物,3-6是用来衡量菌种的生产性能，如能满足这几条，便有希望成为效益高的生产菌株,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,较复杂；应根据分离目的灵活掌握,土壤（丰富、 5-

6、25cm、土质、酸碱度、植被状况、地理条件、季节）,食品 、海水、动物、植物、极端环境,根据微生物的营养类型采样,森林土中有相当多枯枝落叶和腐烂的木头，富含纤维素，适合利用纤维素作碳源的纤维素酶产生菌生长。,肉类加工厂附近、饭店排污沟，易分离到蛋白酶和脂肪酶产生菌。 面粉加工厂等场所易分离到产淀粉酶、糖化酶的菌,根据微生物的生理特性采样,筛选高温酶产生菌通常从温泉、火山爆发处、堆肥等采样；,筛选产低温酶的微生物，可从冰窖、南极、深海等采样 分离耐高渗透压酵母菌，可到甜果、蜜饯、甘蔗渣堆积处采样,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,采样时要注意的问题,富集的三种方案：,定向培养:采用特定的有利于目

7、的微生物富集的 条件（加热、膜过滤等），进行培养。,目的微生物富集的一些基本方法,富集的目的：,让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。,当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分 类学中考虑，,不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这 时只能通过随机分离的办法,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,定向培养的富集方法,1、底物,2、pH条件,3、培养时间,4、培养温度,等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、液体；分批连续）后使目的微生物在种群中占优势。,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,目的菌的分离和筛选,从产物角度出发,在培养时以产物的形成有目的的设计培养基,利用简单、快速的鉴

8、定方法，如抗生素,从形态的角度,菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别。,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,透明圈法,分离水解酶产生菌时较多采用，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、核酸酶等；,在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊； 能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应菌株利用底物的能力。,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,土壤经巴氏消毒，以减少不产芽孢的微生物；然后铺在pH8-9的琼脂培养基（含有均匀的不溶性蛋白质）表面；碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性蛋白质，产生一透明圈。,例如用此法分

9、离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,分离某种产生有机酸的菌株时，也通常采用透明圈法初筛 在选择培养基中加入碳酸钙，使平板呈混浊状，产酸菌能够把菌落周围的碳酸钙水解，形成清晰的透明圈。 透明圈的大小不能完全作为选择高产菌的依据，因为在深层培养中的产酶单位与平板上圈的大小之间并不完全成正比。 但作为初筛的手段是有意义的,如何分离磷细菌？,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,变色圈法,对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平板中加入指示剂或显色剂，使目的微生物菌落周围呈现变色圈，从而能被快速鉴别出来；,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,用含0.2%果胶为唯一碳源的培养基

10、平板，对含微生物样品进行分离，待菌落长成后，加入0.2%刚果红溶液染色4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会出现绛红色水解圈。,如 筛选果胶酶产生菌,甘油三丁酸酯为底物 罗丹明B为指示剂 荧光圈,又如 分离解脂微生物,豆油作底物 中性红（红黄. 6.88.0. ）指示 菌落周围呈红色圈,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,生长圈法, 通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌,将待检菌涂布于高浓度工具菌并缺少所需营养物的平板上进行培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌落周围便会形成一个混浊的生长圈, 工具菌（指示菌）是一些相对应的营养缺陷型菌株,如

11、 嘌呤营养缺陷型大肠杆菌与不含嘌呤的琼脂混合倒平板，在其上涂布含菌样品保温培养，周围出现生长圈的菌落即为嘌呤产生菌,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,抑菌圈法, 常用于抗生素产生菌的分离筛选,据估计，筛选1万个菌株才能得到1株有用的抗生素产生菌；因此，设计一个准确、快速的筛选模型十分重要。 抑菌圈法是常用的初筛方法, 工具菌采用抗生素的敏感菌,若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等，便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,抗生素产生菌的分离,抑菌圈法、扩散法、生物自显影法等,试验菌的选择是关键（关系到灵敏度、活性、抗菌谱等）,采用联合试验菌（枯草杆

12、菌和绿色产色链霉菌或巴氏梭状芽孢杆菌）分离到黄霉素,采用专一性强的筛选技术也是检出新抗生素的有效方法 主要是利用抗生素作用机制相关的酶、酶抑制剂、激活剂等建立的筛选技术 如棒酸（clavulanic acid）的发现：通过鉴定氨苄青霉素和待测样品对-内酰胺酶产生菌克雷氏菌的协同抑制作用,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,抗肿瘤药物产生菌的分离,临床上有效的抗肿瘤药物大多是直接作用于核酸或抑制核酸生物合成的物质 大部分具有抗菌或抗真菌的活性 现发展出利用微生物筛选作用于DNA 的抗肿瘤药物的方法，如生化诱导分析法,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,酶抑制剂产生菌的分离, 某些酶与病理相关, 如果

13、某种化合物能在体外抑制某关键的人体酶， 它就可能在体内有药理作用, 选择与生理和病理关系明确的酶作为靶酶,靶 区 靶 酶 抗高血压 血管紧张素转移酶 抗糖尿病 -淀粉酶、蔗糖酶等 抗血脂症 缩合酶 抗组氨 组氨酸脱羧酶、组氨-N-甲基转移酶,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,生长因子产生菌的分离,通过观察分离菌能否促进营养缺陷型菌株的生长，来检测生长因子产生菌。,分离培养基上培养,被杀死的菌落周围有无检测菌的生长圈,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,第二节 发酵高产菌种选育,菌种选育是应用微生物遗传和变异理论，用人工方法(或自然)造成变异，再经过筛选以得到人们所需菌种的过程 。 菌种选育的目的

14、是为了不断提高发酵工业产品的产量和质量，增加新产品和适应工艺改革的要求。 菌种选育的方向是选育“吃粗粮”、耐高温、生长快、代谢旺、产量高、质量好、无毒性的优良菌株。 微生物育种的方法包括自然育种、诱变育种、细胞工程育种和DNA重组技术育种等。,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,自然选育,在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程叫自然选育。,自发突变(spontaneous mutation)，也称自然突变，指某些微生物在没有人工参与下所发生的那些突变，但这决不意味着这种突变是没有原因的。,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,自然突变两种情况： 生产上所不希望的：菌种的

15、衰退和生产质量下 降 对生产有益的： 生产性能提高,制备单孢子（单细胞）悬液 适当稀释 在固体平板上分离 挑取部分单菌落进行生产能力测定 经反复筛选以确定生产能力更高的菌株替代原来的菌株,自然选育的一般程序,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,自然选育简单易行，可以达到纯化菌种、防止菌种衰退、稳定生产、提高产量等目的。 自然选育的最大缺点是效率低、进展慢，很难使生产水平大幅度提高。,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,诱变育种,诱变育种就是人为地利用物理或化学等因素，使诱变 对象细胞内的遗传物质发生变化，引起突变，并通过筛选 获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。, 诱变育种不仅可以提高菌种的生产能力，且可改进产品 质量、扩大品种和简化生产工艺。, 目前发酵工业中应用的生产菌株大部分是诱变育种得来的。以青霉素为例，1943年开始生产