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1、第六章 仪器分析,上海市医药学校 Office:药物分析课题组,模块一 紫外分光光度法,第二节 分光光度法,学习内容： 理解比色法和分光光度法的基本原理； 了解紫外分光光度计的基本原理 学会紫外分光光度计的保养； 工作内容： 规范操作722s分光光度计 规范操作755B紫外分光光度计,工作任务一,使用722S型分光光度计测定高锰酸钾的吸收光线 使用722S型分光光度计测定高锰酸钾溶液的浓度 绘制标准曲线 测定未知样品的吸光度 求算未知样品的浓度 思考题的讨论 完成实训报告书,任务一： 722S型分光光度计的操作步骤,开机、预热 确定滤光片位置 本仪器备有减少杂散光，提高340380nm波段光度
2、准确性的滤光片，位于样品室内侧，用一拨杆来改变位置。 当测试波长在340380nm波段内如作高精度测试可将拨杆推向前， 通常可不使用此滤光片，可将拨杆置在4001000nm位置。,调整波长 使用仪器上波长调节旋钮，即可方便地调整仪器当前测试波长，具体波长由旋钮左侧的显示窗显示，读波长数时目光垂直观察。 调整功能键 TRANS.透射比 ABS.吸光度 FACT.浓度因子 CONC.浓度直读,任务一： 722S型分光光度计的操作步骤,调整透光率 功能键放置于“T” 调100%：将用作背景的空白样品置入样品室光路中盖下试样盖（同时打开光门），按下“100%T”键即能自动调整100%T（一次有误差时可
3、加按一次）。 调0%：打开试样盖（关闭光门）或用不透光材料在样品室中遮断光路，然后按“0%”键，即能自动调整零位。,任务一： 722S型分光光度计的操作步骤,测定吸光度 功能键放置于“A” 改变试样槽位置让不同样品进入光路 仪器标准配置中试样槽架是四位置的，用仪器前面的试样槽拉杆来改变，打开样品室盖以便观察样品槽中的样品位置最靠近测试者的为“0”位置，依次向外拉出相应的为“1”“2”“3”位置，当拉杆到位时有定位感，到位时请前后轻轻推动一下以确定定位正确。 读取数值并记录。,任务一： 722S型分光光度计的操作步骤,任务二：吸收光谱曲线的绘制教师演示,标准溶液的配制 准确称取高锰酸钾（基准）0
4、.125g,在小烧杯中溶解，定量移入1000mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀。 试样准备 吸取上述标准溶液20mL于50mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀 测定 1cm比色皿，以蒸馏水作空白 波长选择：450、460、480、500、520、 525（此处多选几点）、530、540、560、580、600 分别测定个波长下的吸光度A。 绘制吸收光谱曲线 以波长为横坐标，以吸收度为纵坐标，绘制曲线 找出最大波长max。,任务三：标准曲线的绘制学生分组实训,标准系列溶液 取6只25ml的容量瓶，分别精密加入高锰酸钾标准溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00ml,加
5、蒸馏水稀释至刻度，摇匀 测定 波长选定为max，以1号为空白 依次测定26号标准系列比色液的吸光度A值。 绘制标准曲线 以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标 准曲线。,任务四：样品的测定学生分组实训,样品试液的配制 取1只25ml的容量瓶，精密加入高锰酸钾样品液5.00ml,（约含KMnO40.5mg）,加蒸馏水稀释至刻度，摇匀。 测定吸光度 在相同条件下，测定样品的吸光度 计算 从标准曲线上查出相应浓度的KMnO4 浓度，即为样品比色液的浓度。,概述,光谱分析 含义：根据物质对光的选择性吸收及光的吸收定律对物质进行定性和定量分析的分析方法。 分类：比色法、分光光度法 比色法 含义：比色分析
6、法（简称比色法）就是通过比较有色物质溶液颜色深浅测定物质含量的分析方法。 分类：目视比色法、光电比色法,目视比色法 标准系列比色液 样品液与标准液比色,概述,一致,分光光度法 含义：根据物质对一定波长光线的吸收程度已确定物质含量的分析方法。运用棱镜或光栅作为分光器，用光电管和检流计测量溶液透射光的强度，并直接表示出透光率和吸收度，从而求得被测液浓度或含量。 分类：紫外可见分光光度法、红外分光光度法,一、概述,一、比色法和分光光度法特点,灵敏度高 适用于测量微量物质，最低浓度为10-5-10-7mol/L， 有一定的准确度 比色法相对误差为5-20%，分光光度法的相对误差为2%-5% 操作简便，
7、测定快速 只需要几分钟到十几分钟，甚至更短 应用范围广 几乎所有的无机离子和许多有机化合物均可直接或间接地用比色法或分光光度法测定,二、比色法和分光光度法的原理,比色法和分光光度法的依据是物质对光的选择吸收 光的基本性质,光的波长与其能量或频率成反比关系 光的波长越短，频率或能量越高 光的波长越长，频率或能量越低,波粒二象性,E光子的能量； h普朗克常数； C光的传播速度 光的频率，Hz； 光的波长，nm,二、比色法和分光光度法的原理,常用波长来表示各种不同的电磁辐射 人眼睛能觉察到的波段称为可见光，波长范围400-760nm 红外线(760nm)、紫外线（400nm）、X射线 按照电磁波波长
8、大小顺序可把电磁波划分成几个区域，叫做光谱区域，由各光谱区域按顺序排成的系列叫做电磁波谱,电磁波谱,1.光的性质,单一波长的光称为单色光 由不同波长的光混合而成的光称为复合光 让一束白光通过棱镜，可分解为红、橙、黄、绿、青、蓝、紫七种颜色的光，这种现象称为光的色散 将两种适当颜色的单色光按一定强度比例混合可成为白光，这两种单色光称为互补色光。,互补色光,2.吸收光谱,吸收光谱曲线 将不同波长的单色光依次通过一定浓度的溶液，测量每一波长下溶液对各种单色光的吸收程度（吸收度A），然后以波长（）为横坐标、吸收度（A）为纵坐标作图，即得一吸收光谱曲线。 吸收度最大处所对应的波长称为最大吸收波长，max
9、,物质吸收不同波长的光的特性 只与溶液中物质的结构有关, 与溶液的浓度无关. 不同物质的光谱曲线不同 吸收光谱曲线作为定性的依据,A,/nm,525,0,将不同波长的单色光依次通过一定浓度的溶液，测量每一波长下溶液对各种单色光的吸收程度（A），以波长（）为横坐标，吸光度为纵坐标得到的一条曲线。,吸收光谱曲线,max,I0 = Ia + It 透光率 吸光度,3.光的吸收定律,朗伯-比尔定律,含义 当一束平行的单色光通过均匀、无散射现象的溶液时，在单色光强度、溶液温度等条件不变的情况下，溶液的吸光度与溶液的浓度和液层的厚度的乘积成正比。 应用范围 适用于单色光和一定范围的低浓度溶液 溶液浓度过大
10、，透光性质发生变化，吸光度与浓度不成正比关系 波长较宽的混合光影响光的互补吸收，也会使测定产生误差,A = KcL,吸收系数(K)也称吸光系数 百分吸收系数（比吸收系数） 摩尔吸收系数 = = ,A = K c L,=,c(g/100mL) L(cm),A,A,c(mol/L) L(cm),10,M,浓度为1%(g/100mL)的溶液 厚度为1cm时的吸光度， 单位是mL/(gcm),浓度为1mol/L的溶液 厚度为1cm时的吸光度， 单位是L/(molcm),吸收系数在一定条件下是常数 与入射光的波长、物质的性质、溶剂、温度及仪器的质量等因素有关 数值越大，表明有色溶液对光越容易吸收，测定的
11、灵敏度越高 一般值在103以上，即可进行分光光度测定 吸收系数是定性和定量分析的重要依据,应用,氯霉素（M=323.15g/mol）的水溶液，在278nm处有最大吸收，设用纯品配制100mL含氯霉素2.00mg的溶液，以1cm的吸收池，在278nm处测得吸光度为0.614，求和 有一浓度一定的溶液，用1cm吸收池进行测定时，其透光率为60%，若改用2cm的吸收池进行测定，求其吸光度和透光率 有一浓度为2.510-4mol/L的KMnO4溶液在525nm的摩尔吸收系数为3200，当吸收池的厚度为1cm时，计算其吸光度及透光率各为多少？,1、标准曲线法,前提 固定条件光强度、溶液温度等K不变 统一溶液的厚度L不变,过程： 配制标准系列 样品,例： 芦丁含量测定,（1）分别移取0.2000mg/mL的标样 05mL25mL （2）取样品3.0mg25mL,学习小结,通过本课程的学习，你将掌握如下内容了吗？ 光谱分析法的含义及分类 分光光度法的原理 朗伯-比尔定律的计算（一） 作业： 第128页：1、2、3、4、7、8、14,,Thank You !,
