原核微生物课件

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1、第二章 微生物的纯培养和显微技术 (原核微生物),第一节 微生物纯培养 本节提要： 微生物纯培养的接种方法 灭菌与无菌操作 微生物的保藏技术,纯培养（pure culture）： 单个细胞或一种细胞群繁殖得到的后代。 对于微生物，由于其主要进行无性繁殖，故纯培养即为克隆。 建立纯培养，证实其纯度无可置疑，并保持不受污染是微生物学家最重要的任务之一。（即控制无杂菌） 一、获得纯培养的方法： 平板分离法 液体分离法 单细胞挑取分离法 选择性培养基分离法 （一）.平板分离法： 1、划线分离法：快速、方便。 分段划线（适用于浓度较大的样品） 连续划线（适用于浓度较小的样品） 扇形划线 方格划线,2、稀

2、释倾注分离法： 可定性、定量。 方法：先取稀释液注入平皿，再注入45左右的培养基，将稀释液冲开培养基表面、中间均会出现菌落。 3、涂布平板法（培养基表面出现菌落） 简单易行，但易造成机械损伤。,（二）液体分离法 适用于细胞较大的微生物。用液体培养基对菌液做10倍系列稀释，使试管中只存在一个细胞，由此繁殖得到的后代必是纯培养。,（三）单细胞（单孢子）分离法 较大的微生物可用毛细管挑取单个个体；个体较小的微生物，需用显微操作仪，在显微镜下进行。 （四）.选择培养分离（通常做成固体的培养基） 利用选择培养基进行直接分离。 富集培养。即利用不同微生物间的生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，使适应该

3、条件的微生物旺盛生长，其数量大大增加，便于分离到特定的微生物 固体培养各种微生物形成的菌落特征,固体培养各种微生物形成的菌落特征,二、纯培养的接种方法 根据菌的生长速度的快慢来选择 斜面接种、液体接种 。 （一）斜面接种： 为保存菌种和获得大量菌种 （1）密涂布法(适用于各种M，可获得大量菌体） （2）蛇形划线法(适用于易扩散的M） （3）中央划线法（适用于生长快的M） （4）点种法（适用于真菌短时间保存菌种）,（二）穿刺接种法： 用于接种试管深层琼脂培养基，以观察细菌运动及鉴定细菌用。,（三）液体接种法 用接种针在液面边缘-产生混浊-搅匀、振荡,三、无菌技术 无菌操作：防止微生物进入物体的技

4、术。 无菌：指没有活的微生物（包括芽孢）。 死亡：指不可逆地丧失了生长繁殖的能力。 除菌：应用机械的方法（过滤、离心分离、静电吸附）除去液体或气体中的微生物。 灭菌操作： 杀灭所有微生物 常用 湿热灭菌：高压蒸汽灭菌 干热灭菌：空气加热灭菌 高温灼烧：用火直接接触烧灭,四、菌种保藏 传代培养保藏 冷冻保藏 干燥保藏,第二节 显微镜和显微技术 一、显微镜的种类及原理（p21-25） 种类 普通光学显微镜 暗视野显微镜 相差显微镜 荧光显微镜 透射电子显微镜(transmission electron microscope TEM ) 扫描电子显微镜(SEM ) 扫描隧道显微镜 (STM ） 原子

5、力显微镜(AFM),2.原理 显微镜的作用主要是放大作用。一般利用目镜和物镜两组透镜 来放大成像，组成由机械装置和 光学系统两大部分。 除了放大外，决定显微观察效果的还有两个重要的因素，即分辨率和反差。 分辨率：指辨别两点之间最小距离的能力。即最小可分辨能力。 0.5 分辨率=- nsin 显微镜的分辨率的比较图，书 23页图2-10 反差：样品区别于背景的程度 与显微镜的自身特点有关； 显微观察时对显微镜的正确使用； 良好的标本制作和观察技术，,二、显微技术 1.良好标本的制备 光学显微镜的制样 活体观察 压滴法、悬滴法、菌丝埋片法 染色观察 活菌染色、 死菌染色 正染色和负染色 电子显微镜

6、的制样 透射电镜样品的制备 电子的穿透能力有限，需采用覆盖有支持膜的载网来承载被观察的样品。 常用负染技术 投影技术 超薄切片技术 扫描电镜样品的制备 主要要求干燥 ，并且表面能够导电，常用自然干燥、真空干燥、冷冻干燥等。 干燥、喷镀金属导电层后观察。,2、分析技术 对显微镜的正确使用 了解显微镜的构造和性能。 观察技术 不仅观察物体的形态、结构，可进行的摄影技术，而且与计算科学技术结合的图像分析、模拟仿真技术。 对物体的组成成分定性和定量。,第二节 原核微生物,1.原核微生物的特点 1）没有发育完全的核，DNA高度折叠 为核区，拟核； 2）没有细胞器，细胞膜内陷形成不规 则泡沫结构体系； 3

7、）不进行有丝分裂。,2.本章授课重点 细菌、放线菌、蓝细菌,第一节 细菌（bacteria）,一、细胞的形态构造及其功能,（一）形态和染色,球状,杆状,螺旋状,基本形态,一、细胞的形态和大小,（一）细菌形态,1、球状,细胞个体呈球形或椭圆形，不同种的球菌在细胞分 裂时会形成不同的空间排列方式，常被作为分类依据。 分有：单球菌、双球菌（肺炎球菌）、四联球菌、 八叠球菌（甲烷球菌）、链球菌、葡萄球菌。,一、细胞的形态构造及其功能,（一）细菌的形态,2、杆状,细胞呈杆状或圆柱形，一般其粗细（直径）比较 稳定，而长度则常因培养时间、培养条件不同而有较 大变化。 分有：单杆菌、双杆菌和链杆菌。,炭疽病的

8、病原菌 -炭疽杆菌,一、细胞的形态和大小,（一）细菌形态,3、螺旋菌,螺旋菌呈螺旋卷曲状，螺纹不满一圈的称为弧菌。,一、细胞的形态构造及其功能,（一）形态和染色,3、螺旋状,弧菌,螺旋菌,螺旋体菌,弧菌：,菌体只有一个弯曲，其程度不足一圈， 形似“C”字或逗号，鞭毛偏端生。,蛭弧菌,霍乱弧菌,螺旋菌：,菌体回转如螺旋，螺 旋数目和螺距大小因 种而异。鞭毛二端生 细胞壁坚韧，菌体较 硬。,二、细菌的大小与重量,细菌的大小测量单位是um,大小的测量方法,显微镜测微尺,显微照相后根据放大倍数进行测算,细菌的大小以微米（m）计。 多数球菌的大小（直径）为0.52.0 m； 杆菌（长宽）为（15）（0.

9、51.0）m； 螺旋菌（宽度弯曲长度）为（0.251.7）（260）m；,另外，细菌的大小与个体的发育情况有关，刚分裂的新细菌小，随发育逐渐变大，老化后又变小。,二、细胞的结构,一般结构：细菌都有的构造,特殊结构：部分细菌具有的或 一般细菌在特殊环境下才有的,1、细菌细胞的一般构造,细胞壁（cell wall）是位于细胞体表最外层，内侧紧贴细胞膜的一层较为坚韧且略具弹性的细胞结构。约占干重的1025%。,1）细胞壁（cell wall),不同细菌的细胞壁化学组成和结构不同，通过革兰氏染色法可将所有的细菌分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G）。,细菌是单细胞结构。,(1)革兰氏阳性菌（G+

10、 )的细胞壁成分,G+菌细胞壁化学组成以肽聚糖(peptidoglycan)为主。这是原核微生物所特有的成份，占细胞壁物质总量的4090%。 另外还含有磷壁酸及少量的蛋白质和脂肪。,G+菌细胞壁较厚，约为2080nm，结构简单。,(2)革兰氏阴性菌（ G）的细胞壁成分,主要成份为：脂多糖、磷脂、脂蛋白、肽聚糖，G有肽聚糖，仅占细胞壁干重的5-10%。,G细胞壁很薄，厚度约为10nm，但它的组成和结构比G+更复杂。分为外壁和内壁。其中，外壁又可分为三层：最外层为脂多糖，中间层为磷脂层，内层为脂蛋白。,肽聚糖： 肽聚糖是由N乙酰胞壁酸（NAM）和N乙酰葡萄糖胺（NAG）双糖以及少数氨基酸短肽链组成

11、的亚单位聚合而成的大分子复合体呈长链骨架状。 肽聚糖单体p40 由NAG 和NAM 双糖、四个氨基酸分子按L 型与D 型交替连接的肽尾或侧链、肽桥或肽间桥构成。 3）肽聚糖的特点: 1)为原核生物所特有(古细菌例外)； 2)D-Glu, D-Ala, M-DAP在自然界蛋白质中不存在（ M-DAP是一种在原核微生物细胞壁上才有的内消旋二氨基庚二酸）； 3)个别菌中DAP可为Lys代替； 4)一般由五个氨基酸组成肽桥连接肽尾，个别菌中两肽尾可直接由肽键连接，肽聚糖的多样性就是变化在肽桥上。,革兰氏阴性菌,肽聚糖,肽聚糖网格状结构:,磷壁酸又名垣酸，是大多数G+菌所特有的成分，约占细胞壁成分的10

12、%。,(3)G+ 细菌与G -细菌细胞壁的比较,总结： 1.G+菌具有大量的肽聚糖，独含磷壁酸，不含脂多糖； 2. G-菌含有少量的肽聚糖，独含脂多糖，蛋白质含量较多，不含磷壁酸。,细胞壁的生理功能,1.保护原生质体免受渗透压引起的破裂作用； 2.维持细菌的形态。 溶菌酶处理不同形态的菌体细胞壁后，菌体均呈球状。 3.细胞壁为多孔结构的分子筛，可以阻挡某些分子的进入。 4.细胞壁为鞭毛提供支点，使鞭毛运动。,2）、细胞膜,（1）细胞概念：,细胞质膜（cytoplasmic membrane），又称质膜 （plasma membrane）、细胞膜（cell membrane）或内膜（inner

13、membrane），是紧贴在细胞壁内侧、包围着细胞质的一层柔软、脆弱、富有弹性的半透性薄膜，厚约78nm。约占细菌体重的10左右。,（2）细胞膜的化学组成与结构模型：,细胞膜的化学组成主要为蛋白质、脂类和多糖。 蛋白质（占50%70%） 脂类为磷脂（占20%30%） 多糖约占2。,（2）细胞膜的化学组成与结构模型：,亲水的极性端,疏水的非极性端,（3）细胞膜的生理功能：,是维持细胞内正常渗透压的屏障；选择性地控制细胞内、外的营养物质和代谢产物的运送；,含有合成细胞壁和形成横膈膜组分的酶，合成细胞壁重要基地；,膜内陷形成中间体，含有叶绿素，参与光合作用。,还有吗？,（3）细胞膜的生理功能：,膜上

14、含有氧化磷酸化、NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)脱氢酶等能量代谢的酶系，在细胞质膜上进行物质代谢和能量代谢，是细胞的产能场所；,细胞质膜上有鞭毛基粒，是鞭毛基体的着生部位和鞭毛旋转的供能部位；,细胞质的主要成分为核糖体、内含颗粒、多种酶类和中间代谢物、质粒、各种营养物和大分子的单体等。,3）细胞质和内含物,（1）概念：,细胞质（cytoplasm）是细胞质膜包围的除核区外 的一切半透明、胶状、颗粒状物质的总称。含水量约 80%。,核糖体是细胞质中的一种核糖核蛋白的颗粒状物质， 由核糖核酸RNA(60%)和蛋白质(40%)组成，常以游离状态或多聚核糖状态分布于细胞质中。它是蛋白质的合成场所。,(

15、2)核糖体(ribosome),（3）贮藏物(reserve materials)：即内含颗粒,贮藏物是一类由不同化学成分累积而成的不溶性沉淀颗粒。当细菌生长到成熟阶段，因营养过剩而形成。主要功能是贮存营养物。,异染粒(metachromatic granules) 因其可用蓝色的染料（甲苯胺蓝或甲烯蓝） 颗粒大小为0.51.0m，是无机偏磷酸的聚合物，一般在含磷丰富的环境下形成。 功能是贮藏磷元素和能量，当老龄细菌中，异染粒常被用作碳源和磷源。,聚-羟丁酸(poly-hydroxybutyrate, PHB) 为脂溶性物质，不溶于水。很容易被脂溶性染料苏丹黑着染，在光学显微镜下清晰可见。 当缺乏营养时，被用作碳源和磷源。,硫粒 一些硫化菌如：贝日阿托氏菌可以利用H2S作为能源， 氧化为硫粒积累在菌体，当缺乏营养时，氧化体内硫粒为SO42-,从中获得能量。 硫粒具有很好的折光性，在光学显微镜下可轻松看到。,肝糖和淀粉粒 均可用碘染色，前者为红褐色，后者为蓝色，二者可作为碳源和能源。,细胞内含物 ( Madigan et al., 2000) A. 细胞中的硫滴 B. 聚羟基丁酸颗粒,气泡（gas vocuole）,许多光合营养型、无鞭毛运动的水生细菌中存在的充 满气体的泡囊状内含物，大小为0.21.0m75nm， 内由数排柱形小空泡组