β-内酰胺类抗生素高分子杂质测定法课件

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1、2019/4/19,1,-内酰胺类抗生素高分子杂质测定法,2019/4/19,2,第一节 -内酰胺类抗生素中的高分子杂质,一、定义 -内酰胺类抗生素（-lactam antibiotics）系指化学结构中具有-内酰胺环的一大类抗生素，包括临床最常用的青霉素（penicillins）与头孢菌素（cephalosporin），以及近年开发的头霉素类、硫霉素类、单环-内酰胺类等其他非典型-内酰胺类抗生素。 系对药品中分子量大于药物本身的杂质的总称。其分子量一般在10005000，个别可至约10000道尔顿，小于化工、生化领域中所指的高分子化合物的分子量。,2019/4/19,3,-内酰胺类抗生素中的

2、高分子杂质,二、分类及来源 按其来源分为两类：外源性杂质和内源性杂质。 外源性杂质：包括蛋白、多肽、多糖等类杂质或抗生素和蛋白、多肽、多糖等的结合物。一般来源于发酵工艺，如青霉素中的青霉噻唑蛋白、青霉噻唑多肽等。,2019/4/19,4,内源性杂质：抗菌药物自身聚合产物。聚合物即可来自生产过程，又可在储存中形成，甚至在用药时使用不当也可产生。 抗生素聚合物的免疫原性通常较弱，但作为多价半抗原，可引发速发型过敏反应。,免疫原性(immunogenicity)：抗原刺激机体产生免疫应答，诱生抗体或致敏淋巴细胞的能力。 抗原性(antigenicity)：抗原与其诱生的抗体或致敏淋巴细胞有特异性结合

3、的能力。也写作反应原性。,完全抗原：同时具备2个性质。天然的蛋白质都是完全抗原。 半抗原(hapten)：只有抗原性而没有免疫原性的物质，即只能与抗体结合，却不能单独诱导抗体产生的物质，称为半抗原。一般分子量较小，如化学药物。半抗原+载体(carrier)完全抗原 。,速发型过敏反应是一种常见的过敏反应，主要为呼吸道过敏反应、消化道过敏反应、皮肤过敏反应以及过敏性休克。,随着现代生产工艺的不断改进和提高，目前产品中外源性杂质日趋减少，对内源性聚合物的控制是当前抗生素药物高分子杂质控制的重点。,2019/4/19,5,图1 水温引起阿莫西林干糖浆中高分子杂质含量的变化,2019/4/19,6,-

4、内酰胺类抗生素中的高分子杂质,三、形成机理及结构特征 （一）青霉类抗生素：高分子杂质有蛋白（多肽）类杂质和聚合物杂质两大类。,2019/4/19,7,青霉噻唑多肽： 制剂中的青霉噻唑多肽的分子量主要分布在35002400道尔顿左右，有青霉素的-内酰胺环和多肽的伯氨基按亲核反应机理缩合而成，主要发生在发酵工艺中。样品在储存过程中，多肽类杂质残留的自由氨基仍与-内酰胺反应，直至被饱和，反应速度和样品本身的水分含量及储存温度有关。,2019/4/19,8,青霉噻唑蛋白的基本结构,青霉素G,内酰胺环断裂点,2019/4/19,9,青霉素聚合物： 1.反应仅和母核结构有关，侧链中的活性基团不参与反应。

5、一分子青霉素首先开环，形成一新的活性位点，并与另一分子青霉素聚合。 2.侧链参与的聚合反应 主要以氨苄青霉素为代表，反应时侧链上的氨基亲核攻击-内酰胺抗生素的羰基碳原子，形成聚合物。,2019/4/19,10,头孢菌素：头孢菌素中的高分子杂质主要是不同类型的聚合物。 1.只与母核结构有关的N型聚合反应 eg. 头孢噻吩、头孢呋辛、头孢哌酮等 2.侧链参与的L型聚合反应。 eg. 头孢氨苄、头孢拉定、头孢噻肟等 在碱性条件下，两种反应都可以发生。,2019/4/19,11,-内酰胺类抗生素中的高分子杂质,四、结构特点 高度的不均一性和不确定性。 1.青霉噻唑多肽（蛋白）类杂质 发酵中产生的任何蛋

6、白及蛋白碎片都可能带入到产品中；相同的蛋白或蛋白碎片上可以结合不同数目的药物分子。,2019/4/19,12,2.聚合物类杂质：青霉素、头孢菌素不仅能形成聚合度不同的聚合物，许多样品还能同时发生不同机理的聚合反应。 3.形成的聚合物可发生不同程度的分（降）解反应，如开环等。 4.对以异构体形式存在的样品，同聚和异聚反应可同时发生。 5.实践中发现高分子杂质的种类及数量和生产工艺密切相关，如氨苄西林钠，溶媒法和喷雾干燥法的高分子杂质具有不同的特异性，且二者的聚合物含量明显不同。,2019/4/19,13,-内酰胺类抗生素中的高分子杂质,五、影响聚合物形成的因素 1.青霉素的聚合物 青霉素的聚合反

7、应速度在溶液条件下和溶液的酸碱度关系密切；在固体条件下主要和样品的水分含量有关。,2019/4/19,14,2.头孢菌素的聚合物 固体状态下头孢菌素类产品聚合速度与含水量和贮存温度的关系密切。 贮存温度较低时，含水量差异对聚合物含量尽管有影响，但影响不大；但当贮存温度上升至37时，含水量差异对聚合物含量的影响十分显著。,2019/4/19,15,-内酰胺类抗生素中的高分子杂质,六、口服青霉素类药物使用前进行皮试的必要性 口服青霉素类抗生素在国内外均有过敏反应报道，但其原因未有试验报道。有相关报道，在青霉素V聚合物可经胃肠道吸收而引发过敏反应。因此，在口服青霉素类抗生素前，必须进行皮肤过敏试验，

8、这是十分必要的。,2019/4/19,16,-内酰胺类抗生素中的高分子杂质,七、抗生素高分子杂质的质控意义 1. -内酰胺类抗生素中的高分子杂质是引发临床速发型过敏反应的过敏原； 2.高分子杂质经注射和口服都可引起过敏反应，因此注射剂和口服剂都应控制。 3.高分子杂质是-内酰胺类抗生素质量评价的重要指标，可评价药品质量和稳定性，并可借此进一步评价其生产工艺。,2019/4/19,17,第二节 高分子杂质分析方法,一、概述,2019/4/19,18,由于结构不同的高分子杂质通常有相似的生物学特性，如：均为过敏性杂质，因此，在药物质量控制中一般不需分别控制不同结构的高分子杂质含量，而只需控制药品中

9、高分子杂质的总量。故根据分子量差异进行分离的凝胶色谱模式是简便易行的分离模式。 以葡聚糖凝胶Sephadex G-10 为基础的凝胶色谱分析方法，可简便地用于对各种-内酰胺类抗生素中的高分子杂质的分离、分析，并满足药品质量控制的需要。,2019/4/19,19,高分子杂质分析方法,二、凝胶色谱系统的分离原理及特点,2019/4/19,20,凝胶色谱系统的分离原理及特点,1.凝胶色谱法 凝胶色谱法又称分子排阻色谱法。凝胶色谱法主要用于高聚物的相对分子质量分级分析以及相对分子质量分布测试。凝胶色谱法又叫凝胶色谱技术，是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，由于设备简单、操作方便，不需

10、要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。它是利用某些凝胶对混合物各组分因分子量不同，其阻滞作用也不同而进行分离、分析的方法。,2019/4/19,21,凝胶色谱系统的分离原理及特点,2.凝胶色谱系统的分离原理 （1）利用凝胶色谱的分子筛机制，但凝胶的孔径要比分子筛大得多，一般为几百至几千埃。让药物分子自由进入凝胶颗粒内部，而所有的高分子杂质被排阻，进而实现让所有高分子杂质具有相同的保留时间的设想。,2019/4/19,22,凝胶渗透色谱按分子大小分离原理图,2019/4/19,23,凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可以完全或部分排阻某些大

11、分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。 任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。,2019/4/19,24,实验证明， Sephadex G-10 凝胶可基本保证所有的-内酰胺抗生素中的高分子杂质被排阻。 Kav = (Ve-Vo) / (Vt-Vo) Kav:分配系数；Ve：被分离物质洗脱体积； Vo：柱内凝胶床中颗粒间自由空间所占有的体积（外水体积）； Vt：柱内凝胶颗粒占有的体积与外水体积之和（柱床体积） 一般Kav0洗脱的组分视作高分子杂质。,2019/4/19,25,

12、外水体积（Vo） ：凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，即液体流动相体积； 内水体积（Vi） ：凝胶颗粒中孔穴的体积，即固定相体积； 基质体积（Vg） ：凝胶颗粒实际骨架体积。,Vt= Vo+ Vi+ Vg,柱床体积（Vt）：凝胶柱所能容纳的总体积,2019/4/19,26,洗脱体积（Ve） ：将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。 一般是介于Vo和Vt之间的。 （1）对于完全排阻的大分子，由于其不进入凝胶颗粒内部，而只存在于流动相中，故Ve= Vo； （2）对于完全渗透的小分子，由于可以存在于凝胶柱整个体积内，故Ve= Vt； 分子量介于两者之间的分子，其洗脱体积也介于两者之间，但，有时也出

13、现Ve Vt，这是由于这种分子与凝胶的吸附作用造成的。,2019/4/19,27,凝胶层析洗脱示意图,（1）完全排阻的大分子 （2）中等分子 （3）完全渗透的小分子 （4）吸附分子,2019/4/19,28,通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。该物质分子量大（为200万），呈蓝色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助其本身颜色，采用肉眼或分光光度仪检测（210nm或260nm或620nm）洗脱体积（即Vo）。但是，在测定激酶等蛋白质的分子量时，不宜用蓝色葡聚糖2000测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用巨球蛋白代替。,2019/4/19,29,Vo的测定,

14、2019/4/19,30,Vt的测定,2019/4/19,31,（2）由于溶质分子和凝胶介质间存在多种次级相互作用，溶质分子可被吸附于凝胶介质的表面。 （3）在凝胶颗粒内部具有较大的比表面积和较小的自由空间，故溶质分子更易和凝胶介质接触，因此溶质分子在凝胶颗粒内部较凝胶颗粒外部更易被吸附。 （4）即，色谱过程中除分子排阻作用外，凝胶对药物分子的吸附作用大于对高分子杂质的吸附作用。,2019/4/19,32,有目的的利用药物分子和凝胶间的次级相互作用，使药物分子吸附于凝胶颗粒内表面，进而改善高分子杂质和药物分子之间的分离度。 （5）在深入研究药物和葡聚糖凝胶的相互作用及流动相对该相互作用的影响的

15、基础，通过调节色谱过程中的流动相组成、浓度、pH和流速等参数，调节药物分子和凝胶颗粒间的相互作用，进而调节高分子杂质和药物分子间的分离度。,2019/4/19,33,凝胶色谱系统的分离原理及特点,3. Sephadex G-10 凝胶色谱法分离-内酰胺抗生素中高分子杂质的概况： 在Sephadex G-10 凝胶色谱系统中，理论上-内酰胺抗生素三聚体以上的高分子杂质均集中在Kav=0的色谱峰中；调节各种色谱条件，既可使-内酰胺抗生素的寡聚物（如青霉素类抗生素的二聚物等）和其它高分子杂质分离，又可使其二者合二为一，因此可用于不同的分析目的。,2019/4/19,34,高分子杂质分析方法,三、色谱

16、条件对-内酰胺类抗生素在Sephadex G-10 凝胶色谱系统中色谱行为的影响,2019/4/19,35,色谱条件的影响,1.流动相离子强度对溶质保留行为的影响： 流动相的离子强度和色谱行为虽然并无直接联系，但一般说来，当流动相中的离子种类不改变时，离子强度越大， -内酰胺类抗生素的Kav值越大。,2019/4/19,36,在被测物浓度较高时，流动相中应含有足量的缓冲盐以改善色谱峰形和分离效果。 有研究表明，在流动相中添加中性盐如氯化钠或增加缓冲液的浓度后 ，均使离子强度增加，使-内酰胺类抗生素中的高分子杂质得到有效分离。,2019/4/19,37,色谱条件的影响,2.流动相种类对溶质色谱行为的影响： 常用流动相有：柠檬酸缓冲液、硫酸铵缓冲液、磷酸缓冲液、醋酸缓冲液等。 改变流动相中缓冲液的种类，可以改变溶质的色谱行为，对-内酰胺类抗生素，表现为其Kav值的改变及色谱峰型的变化。,2019/4/19,38,流动相中缓冲液种类对头孢菌素色谱行为的影响,2019/4/19,39,流动相对头孢他啶高分子杂质