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1、中药化学的实验基本技能,一、概述,分离并鉴定单体化合物是中药化学的实验的基本要求，也是进一步进行其它相关实验的基础。主要包括分离和鉴定两个步骤。 常说的过柱子应该叫柱层析分离，也叫柱色谱。我们常用的是以硅胶、树脂、凝胶或氧化铝作固定相的吸附或分配色谱柱。由于柱分的经验成分太多，所以下面我就几年来过柱的体会写些心得，希望能有所帮助。,二、柱层析分离,1、柱子可以分为：加压，常压，减压 压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。 减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉
2、能够节省一半甚至更多，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面有水汽凝结），以及有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽气（很大的噪音，而且时间长）。 以前曾经用过减压柱但是自从尝试了加压后，就几乎再也没动过减压的念头了。 加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵（给鱼缸供气的就行）。特别是在容易分解的样品的分离中适用。 压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。本人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。,2、关于柱子的尺寸 应该是粗长的最好柱子长了，相应的塔板数就高。柱子
3、粗了，上样后样品的原点就小（反映在柱子上就是样品层比较薄），这样相对的减小了分离的难度。 试想如果柱子十厘米，而样品就有二厘米，那么分离的难度可想而知，恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。而如果样品层只有0.5厘米，那么各组分就比较容易得到完全分离了。 当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了，不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了。 现在见到的柱子径高比一般在1：510。书中写硅胶量是样品量的3040倍，具体的选择要具体分析。 如果所需组分和杂质分的比较开（是指在所需组分rf在0.20.4，杂质相差0.1以上），就可以少用硅胶，用小柱子（例如200毫克的样品，用2cm20cm的柱子）；如
4、果相差不到0.1，就要加大柱子，我觉得可以增加柱子的直径，比如用3cm的，也可以减小淋洗剂的极性等等。,3、关于湿法、干法上样 湿法上样省事，一般用淋洗剂溶解样品，也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等，但溶剂越少越好，不然溶剂就成了淋洗剂了。 很多样品在上柱前是粘乎乎的，一般没关系。可是有的上样后在硅胶上又会析出，这一般都是比较大量的样品才会出现，是因为硅胶对样品的吸附饱和，而样品本身又是比较好的固体才会发生，这就应该先重结晶，得到大部分的产品后再柱分，如果不能重结晶那就不管它了，直接过就是了，样品随着淋洗剂流动会溶解的。 有些样品溶解性差，能溶解的溶剂又不能上柱（比如DMF,DMSO等，会随着溶剂一
5、起走，显色是一个很长的脱尾），这时就必须用干法上柱了。,干法上样：样品和硅胶的量有一种说法是1：1，我觉得是越少越好，但是要保证在旋干后，不能看到明显的固体颗粒（那说明有的样品没有吸附在硅胶上）。 干法上样溶剂的选择，（最便宜，最安全，最环保）。所以大多选用石油醚，乙酸乙酯。 文献中有写用正己烷的，太贵了，除非特别需要，因为其极性很小，有时还是非它不可。 乙醚也可以用，但是就是容易睡觉，注意保持清醒别让溶剂流干了，那样柱子也就不爽了。 二氯甲烷也有用的，但是要知道，它和硅胶的吸附是一个放热过程，所以夏天的时候经常会在柱子里产生气泡，天气冷的时候会好一些。 甲醇，据说能溶解部分的硅胶，所以产品如
6、果想过元素分析的话要留神，应该经过后继处理，比如说重结晶、过SephadexLH-20柱等。 其他的溶剂用的相对较少，要依个人的不同需要选择了。,由于某些原因，用到的淋洗剂多是大包装的，如10升或25升塑料桶装的，就要注意这些工业品的纯度是较低的。经常能够从送来的大桶底部看见有色的杂质，其他的杂质就可想而知了，所以在比较严格的柱分时就要对溶剂重蒸。当然过原料时就可以免去这一步了，反正下面还有提纯的方法。 另外溶剂在过柱子后最好也回收使用，一方面环保，另一方面也能节省部分经费，缺点是要消耗一定的人工。这里要注意的是，一般在过柱同时进行的是减压旋蒸，石油醚和乙酸乙酯的比例由于挥发度的不同会导致极性
7、的变化，一般会使得极性变大，在梯度淋洗时比较合适，正好极性越来越大了。在过完柱子后，溶剂最后回收要采用常压，因为在减压旋蒸时会有部分低沸点的杂质一起出来，常压时就会减少这种现象。,4、关于操作问题。 4.1 装柱。 柱子下面的活塞一定不要涂润滑剂，会被淋洗剂带到产品中的，可以采用四氟节门的。 干法和湿法装柱觉得没什么区别，只要能把柱子装实就行。 装完的柱子应该要适度的紧密（太密了淋洗剂走的太慢），一定要均匀（不然样品就会从一侧斜着下来）。 在大多数情况下有些小气泡没太大的影响，一加压气泡就全下来了。当然如果你装的柱子总是有气泡就说明需要多练习了。 但是柱子更忌讳的是开裂，甭管竖的还是横的，都会
8、影响分离效果，甚至作废！,4.2 加样 用少量的溶剂溶样品加样，加完后将下面的活塞打开； 待溶剂层下降至柱床表面时，再加少量的低极性溶剂，然后再打开活塞，如此两三次； 加入淋洗剂，一开始不要加压，等溶样品的溶剂和样品层有一段距离（24cm就够了），再加压，这样避免了溶剂（如二氯甲烷等）夹带样品快速下行。,4.3 淋洗剂的选择。 使所需点在rf0.20.3左右的比较好。 不要认为在板上爬高了分的比较开，过柱子就用那种极性，如果rf在0.6，即使相差0.2也不容易在柱子上分开，因为柱子是一个多次爬板的状态，可以通过公式的比较：0.6/0.8一次的分离度，肯定不如（0.2/0.3）的三次方或四次方大
9、。,4.4 样品的收集。 另外，收集的试管大小要以样品量而定，特别是小量样品，如果用大试管，可能一根就收到了三个样品。如果都用小试管那工作量又太大。 4.5 后处理 柱分后的产品，由于使用了大量的溶剂，其中的杂质也会累积到产品中，所以如果想送分析，最好用少量的溶剂洗涤一下，因为大部分的杂质是溶在溶剂里的，一洗基本就没了，必要时进行重结晶。 另外，再过柱的时候，有时会出现气泡，一是和使用的溶剂有关，如果是易挥发的溶剂，如乙醚、二氯甲烷等，在室温稍高的情况下，很容易出现这种现象，因此，在室温高的时候，可以选择沸点较高，挥发相对小的溶剂。 还有，使用混合溶剂时，使用的两种溶剂的沸点应该相差不大，如：
10、乙酸乙酯和石油醚(6090),而乙醚却要选择3060的石油醚。 不论是用带砂板的还是塞棉花的，在装柱之前，都要将空气用加压的方法将空气排干，这样就可避免柱中有空气！过柱子需要耐心，不要着急。,三、组分及化合物的编号,四、化合物结构鉴定,结构测定的顺序 参考文献TLC检测1H-NMR参考文献13C-NMR1H-1H COSYHSQC，HMBCMSNOESYX-rayCA,MS,天然药物结构测定中常用的手段,天然药物结构测定中常用的顺序,5-10mg,氘代试剂,1H-NMR,MS,13C-NMR,ESI-MS,EI-MS,2D-NMR,1H-1H COSY HSQC HMBC DEPT,查新,IR
11、 UV,信号的灵敏度增高 信号与信号间的分离度改善 信号的图形趋于简单化,不同分辨率的1H-NMR的区别,不同溶剂的信号峰，及峰形不同 不同溶剂中的水峰位置不同 同一质子的信号在不同溶剂中的位置不同 氘代溶剂的裂分取决于氘代氢核的数目，即2n1 经验规律: 萜类, 甾体(CDCl3, C5D5N); 黄酮（DMSO-d6) 香豆素，苯丙素等(CD3OD, CD3COCD3),溶剂位移,也叫质子去偶谱，测定该谱时去偶器的频率覆盖了全部质子 的共振频率，故使所有1H对13C核的偶合影响全部消除，每个不等价的碳核在图谱上均表现为一个单峰。另外，由于照射同碳上的质子所产生的增益效应，导致13C核的信号
12、强度增强，提高信噪比。 伯，仲，叔碳的信号强度不同(与各个碳的纵向驰豫时间有关),噪音去偶谱,DEPT谱,1 H-H相关谱 对角峰与相关峰 偕偶，邻偶，烯丙偶合，W型偶合,二 维 FT - NMR,2.C-H相关谱(HMQC) 相关峰,HMBC Spectrum of Compound 7 (CDCl3, 500MHz),3. C-H远程相关谱(HMBC) 相关峰,4.H-H远程相关谱(NOESY) 相关峰与对角峰,3 -hydroxy-8-oxo-eremophila-6,9-dien-12-oic acid,实例,H2O峰,氘代丙酮试剂峰,杂质,1H-NMR spectrum of Compound 1(500MHz, Acetone-d6),OCH3,对称信号,亚甲基信号,谢谢,
