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1、Chapter8 微生物的遗传 变异和育种,遗传：,亲代与子代相似,变异：,亲代与子代、子代间不同个体不完全相同,遗传（inheritance）和变异（variation）是生命的最本质特性之一,遗传型：,表型：,生物的全部遗传因子所携带的遗传信息,具有一定遗传型的个体，在特定环境条件下通过生长发育所表现出来的外表特征和内在特征的总和。,表型是由遗传型所决定，但也和环境有关。,表型饰变：,表型的差异只与环境有关 特点：暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为,遗传型变异（基因变异、基因突变）：,遗传物质改变，导致表型改变 特点：遗传性、群体中极少数个体的行为（自发突变频率通常为10-6-10-
2、9）,微生物是遗传学研究中的明星：,微生物细胞结构简单，营养体一般为单倍体， 方便建立纯系。 很多常见微生物都易于人工培养，快速、大 量生长繁殖。 物种和代谢类型多样 对环境因素的作用敏感，易于获得各类突变株， 操作性强。,8.1 遗传变异的物质基础,8.1.1 三个证明DNA是遗传物质的经典实验,1.经典转化实验,肺炎链球菌,S型,R型,1928年，F.Griffth作了3组实验:,1944年，Avery精确重复了转化实验，确定了转化因子,实验证明，将R菌转化为S菌的转化因子是DNA,2、噬菌体感染实验,实验证明，进入细菌细胞内部的物质是DNA。 DNA包含有产生完整噬菌体的全部信息。,19
3、52年，A.D.Hershey和M.Chase,3、植物病毒重建实验,实验证明，遗传信息的流向与DNA的传递是一致的。,1.细胞水平 2.细胞核水平 3.染色体水平 4.核酸水平 5.基因水平 6.密码子水平 7.核苷酸水平,8.1.2 遗传物质在微生物细胞内存在的部位和方式,8.1.2.1 遗传物质在7个水平上的形式,8.1.2.2 微生物基因组结构的特点,1.原核生物（细菌、古生菌）的基因组,1）染色体为双链环状的DNA分子（单倍体）； 2）基因组上遗传信息具有连续性； 基因数基本接近由它的基因组大小所估计的基因数 一般不含内含子，遗传信息是连续的而不是中断的。 3）功能相关的结构基因组成
4、操纵子结构； 4）结构基因的单拷贝及rRNA基因的多拷贝； 5）基因组的重复序列少而短； 个别细菌(鼠伤寒沙门氏菌和犬螺杆菌)和古生菌的rRNA和tRNA中也发现有内含子或间插序列,2.真核微生物（啤酒酵母）的基因组,1）典型的真核染色体结构； 啤酒酵母基因组大小为13.5106bp，分布在16条染色体中。 2）没有明显的操纵子结构； 3）有间隔区（即非编码区）和内含子序列； 4）重复序列多；,3.原核生物和真核生物的基因组比较,8.1.2.3 原核生物的质粒,1.定义 质粒（plasmid）：一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中。,2.结构特点,通常
5、以共价闭合环状(covalently closed circle，简称CCC)的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中；,也发现有线型双链DNA质粒和RNA质粒；,质粒分子的大小范围从1kb左右到1000kb；,(细菌质粒多在10kb以内）,3、质粒的类型,严紧型质粒(stringent plasmid)：复制行为与核染色体的复制同步，低拷贝数 松弛型质粒(relaxed plasmid)：复制行为与核染色体的复制不同步，高拷贝数,窄宿主范围质粒(narrow host range plasmid) （只能在一种特定的宿主细胞中复制）,广宿主范围质粒(broad host range plasmid
6、) （可以在许多种细菌中复制）,4.质粒在基因工程中的应用 质粒的优点： （1）体积小，易分离和操作 （2）环状，稳定 （3）独立复制 （4）拷贝数多 （5）存在标记位点，易筛选 E. coli的pBR322质粒是一个常用的克隆载体,5.质粒的检测,提取所有胞内DNA后电镜观察；,超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察；,对于实验室常用菌，可用质粒所带的某些特点， 如抗药性初步判断。,6.质粒的主要种类,质粒所编码的功能和赋予宿主的表型效应,致育因子（Fertility factor，F因子） 抗性因子（Resistance factor，R因子） 产细菌素的质粒（Bacteriocin produc
7、tion plasmid） 毒性质粒（virulence plasmid） 代谢质粒（Metabolic plasmid） 隐秘质粒（cryptic plasmid）,8.2 基因突变和诱变育种,8.2.1 基因突变 一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变、可遗传、自发或诱变产生,基因突变,狭义：点突变 广义：基因突变和染色体畸变,野生型（原始性状）,基因突变,突变型（新性状）,8.2.1.1 突变类型,8.2.1.2 突变率 每一世代中发生某一性状突变的几率 8.1.2.3 基因突变的特点,1.自发性,2.不对应性,3.稀有性,4.独立性,5.可诱变性,6.稳定性,7.可逆性,8.2.1
8、.4 基因突变自发性和不对应性的实验证明,证明突变是自发产生的，并且突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系。,野生型 （原始性状）,特定环境,突变型 （适应环境的新性状）,驯化,定向诱变,筛选,？,？,？,？,突变的原因,三个经典实验,变量实验,涂布实验,影印实验,8.2.1.5 基因突变及其机制,1、诱发突变： 物理、化学与生物的因素，提高突变率的人为的作法,（1）碱基的置换,碱基的置换引起的突变,（2）移码突变：添加或缺失核苷酸，引起阅读错误,（3）染色体畸变：缺失、重复、插入、易位、倒位,2.自发突变,（1）背景辐射,（2）有害产物积累,（3）碱基错配,无人为因素下的低频率突变,原因
9、：,8.2.1.6紫外线对DNA的损伤及其修复,嘧啶,嘧啶二聚体,UV,1、光复活作用,嘧啶二聚体,嘧啶,光解酶,2、切除修复,8.2.2 突变与育种 8.2.2.1 自发突变与育种： 选育 定向培育 8.2.2.2 诱变育种 1.诱变育种的基本环节,2.诱变育种的原则 （1）使用简便有效的诱变剂,诱变剂,物理因素,化学因素,紫外线 激光 离子束 X射线 r射线 快中子,烷化剂 碱基类似物 吖啶化合物,Ames试验：利用细菌模型了解潜在化学致癌物的诱变作用,“生物化学统一性”法则： 人和细菌在DNA的结构及特性方面是一致的，能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA，使其发生突变，最后
10、造成癌变或其他不良的后果。,诱变剂的共性原则： 化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比 超过95%的致癌物质对微生物有诱变作用 90%以上的非致癌物质对微生物没有诱变作用,美国加利福尼亚大学的Bruce Ames教授于1966年发明，因此称为Ames试验 具体操作：检测鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhmurium)组氨酸营养缺陷型菌株(his-)的回复突变率 回复突变：突变体失去的野生型性状，可以通过第二次突变得到恢复，这种第二次突变称为回复突变,证明Ames试验重要性的应用实例： 国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物“反应停”，由于其药效显著，在60-70年代十分流行
11、， 但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高，而且生产畸形儿的妇女大多曾服用“反应停”，后来采用Ames试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用，因此这种药物被禁止使用 但如果能在这种药物上市之前就进行Ames试验检测，那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免，,（2）选用优良的出发菌株 （3）处理单细胞或单孢子悬浮液 （4）使用最佳诱变剂量 剂量 = 强度（浓度） 作用时间 相对剂量 = 杀菌率 （5）利用协同效应 （6）寻找和利用形态、生理与产量间的相关指标 （7）设计高效率筛选方案 （8）根据具体情况创造新型筛选方案,3、突变株的筛选：（1）产量突变株的筛选 （2）抗药性突变株的筛选 （3
12、）营养缺陷型突变株的筛选,突变株的筛选方法,诱变,检出营养缺陷型,淘汰野生型,鉴定营养缺陷型,富集培养 （抗生素法） （菌丝过滤法）,夹层培养法 限量补充培养法 逐个检出法 影印平板法,生长谱法,8.3 基因重组和杂交育种,一、原核生物的基因重组 （一）转化,供体菌,受体菌,DNA片段,1928年，Griffith发现肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae） 的转化现象,目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力 进行自然转化，需要二方面必要的条件：,1、建立了感受态的受体细胞 感受态细胞：具有摄取外源DNA能力的细胞 自然感受态的出现是细胞一定生长阶段的生理特性，受细
13、菌 自身的基因控制； 人工感受态则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNA的 能力，或人为地将DNA导入细胞内 2、外源游离DNA分子（转化因子）,转化过程（革兰氏阳性菌的转化模型）,噬菌体DNA被感受态细胞摄取并产生有活性的病毒颗粒,转染(transfection)：,转染的特点：提纯的噬菌体DNA以转化的（而非感染）途径进入细胞并表达后产生完整的病毒颗粒。,转化过程的特点： a）对核酸酶敏感； b）不需要活的DNA供体细胞； c）转化是否成功及转化效率的高低主要取决于转化供体菌株和转化受体菌株之间的亲源关系； d）通常情况下质粒的自然转化效率要低得多,人工转化,用CaCl2处理细胞，电穿
14、孔等是常用的人工转化手段。,在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组 手段，是基因工程的奠基石和基础技术。,不是由细菌自身的基因所控制；,用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一 种可以摄取外源DNA的“人工感受态”。,质粒的转化效率高；,（二）细菌的转导（transduction）,由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式 一个细胞的DNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中,细菌转导的类型：,普遍转导,局限转导,完全普遍转导 流产普遍转导,低频转导 高频转导,局限转导与普遍转导的主要区别,溶源转变,（三）接合(conjugation),通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传
15、信息的转移和重组过程,1946年，Joshua Lederberg 和Edward L.Taturm 细菌的多重营养缺陷型杂交实验,中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致。,证实接合过程需要细胞间的直接接触的“U”型管实验（ Bernard Davis，1950 ）,接合机制(大肠杆菌的接合机制),接合作用是由一种被称为F因子的质粒介导。 F因子的分子量通常为5107，上面有编码细菌产生性菌毛及控制接合过程进行的20多个基因。,F因子为附加体质粒 既可以脱离染色体在细胞内独立存在，也可插入（整合）到染色体上,F因子的四种细胞形式,a）F-菌株(“雌性”菌株)，不含F因子
16、，没有性菌毛，但可以通过接合作用接收F因子而变成F+菌株； b）F+菌株(“雄性”菌株)， F因子独立存在，细胞表面有性菌毛。 c）Hfr菌株，F因子插入到染色体DNA上，细胞表面有性菌毛。 d）F菌株，Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F因 子。 细胞表面同样有性菌毛。,1） F+F-杂交,理化因子的处理可将F因子消除而使F+菌株变成F-菌株,F+菌株的F因子向F-细胞转移，但含F因子的宿主细胞 的染色体DNA一般不被转移。,a）F+细菌通过性毛与F-细菌接触并发生相互作用； b）F+细菌的F因子出现缺口，双链之一被切断，从断端转移F因子的一条链到F-细菌中。 c）F因子的一条链一进入F-细菌中，就在F-细菌中复制新的 F因子。,d）复制完成后， F-细菌变成F+ ，同时原有F+细胞也完成F因子另一条链的复制，所以转移是F+的拷贝。 所以最终杂交的结果是F-细菌变成F+细菌，而
