人类基因定位与克隆课件

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1、人类基因定位与克隆,定位的方法有体细胞杂交，家系连锁分析，原位杂交，剂量效应法，染色体畸变，限制性酶的精确分析等，其中前三者用得较多。,通过遗传重组所得到的基因在具体染色体上线性排列图称为遗传连锁图。它是通过计算连锁的遗传标志之间的重组频率，确定他们的相对距离，一般用厘摩(cM，即每次减数分裂的重组频率为1%)来表示。 绘制遗传连锁图的方法有很多，随着DNA多态性的开发，使得可利用的遗传标志数目迅速扩增。早期使用的多态性标志有RFLP(限制性酶切片段长度多态性)、RAPD(随机引物扩增多态性DNA)、AFLP(扩增片段长度多态性)；80年代后出现的有SSR(短串联重复序列，又称微卫星)DNA遗

2、传多态性分析和90年代发展的SNP(单个核苷酸的多态性)分析。 ,物理图谱是利用限制性内切酶将染色体切成片段，再根据重叠序列确定片段间连接顺序，以及遗传标志之间物理距离碱基对(bp) 或千碱基(kb)或兆碱基(Mb)的图谱。 以人类基因组物理图谱为例，它包括两层含义，一是获得分布于整个基因组30 000个序列标志位点(STS，其定义是染色体定位明确且可用PCR扩增的单拷贝序列)。将获得的目的基因的cDNA克隆，进行测序，确定两端的cDNA序列，约200bp，设计合成引物，并分别利用cDNA和基因组DNA作模板扩增；比较并纯化特异带；利用STS制备放射性探针与基因组进行原位杂交，使每隔100kb

3、就有一个标志； 二是在此基础上构建覆盖每条染色体的大片段：首先是构建数百kb的YAC(酵母人工染色体)，对YAC进行作图，得到重叠的YAC连续克隆系，被称为低精度物理作图，然后在几十个kb的DNA片段水平上进行，将YAC随机切割后装入粘粒的作图称为高精度物理作图.,基因组,基因组：生物细胞中单套染色体的所含DNA序列的全部组成。 人类基因组：22条常染色体和X，Y染色体的DNA组成。,基因组大小,种类 Mb 大肠杆菌 4.64 啤酒酵母 12.1 线 虫 100 果 蝇 140 蝗 虫 5000 小 鼠 3300 豌 豆 4800 玉 米 5000 小 麦 17000 人 3000,C值悖论,

4、生物体单倍体DNA总量称为 C值。 高等生物具有比低等生物更复杂的生命活动，所以，理论上应该是它们的C值也应该更高。但是事实上C值没有体现出与物种进化程度相关的趋势。高等生物的C值不一定就意味着它的C值高于比它低等的生物。这种生物学上的DNA总量的比较和矛盾，称为C值悖论。,DNA序列的分类,基因序列和非基因序列 基因序列：以起始密码子开始，终止密码子结束的一段DNA序列，称为开放阅读框（open reading frame, ORF） 非基因序列：基因序列以外的DNA序列。 编码序列和非编码序 编码序列：编码RNA和蛋白质的DNA序列。 非编码序：内含子和基因的间隔序列。,单一序列和重复序列

5、 单一序列： 基因组中只有一份的DNA序列。 重复序列：基因组中重复出现的序列。例如，STR，SNP，微卫星DNA等。,寻找基因,什么是基因？ 基因在哪里？,寻找基因的思路：,基因定位,基因克隆,基因分离,将基因定位于染色体上,有大到小，由粗到细，精细定位,克隆目的基因片段,寻找新基因的方法,功能克隆 定位克隆 定位候选克隆 差异表达 生物信息学方法 通过ORF的预测 通过EST的拼接 基因芯片技术,功能克隆,克隆（致病）基因的一种策略。 收集所要克隆的基因的蛋白质产物及其功能的信息，用以分离基因，并对基因进行定位。,性状（疾病）,蛋白质产物（生物学功能）,从氨基酸序列出发设计 DNA引物，从

6、文库调取基因,得到基因序列,染色体定位,疾病,功能,基因,分析异常基因的产物（蛋白质），纯化蛋白质，弄清它是如何引起临床症状的有两条不同的路线： 1. 进行氨基酸序列测定，据此推测可能的核苷酸序列，合成寡核苷酸探针，然后用探针从cDNA文库或基因组文库中筛选对应的编码基因； 将异常蛋白质制成相应的抗体，从cDNA表达文库中筛选相应克隆。得到克隆后，就可以通过DNA序列分析确定导致疾病的分子缺陷。 绝大部分分子病、遗传性代谢缺陷（酶）病如白化病（albinism）、苯丙酮尿症（phenylkeonuria， PKU）和镰刀形细胞贫血病（sickle-cell disease）等，都是采取的这一策

7、略。,血红蛋白病镰刀形细胞贫血症 正常HbA四条多肽链（2条链，两条链）,定位克隆,利用遗传连锁或细胞学定位技术将致病基因定位于染色体的特定区带。 定位：通过连锁分析找出与目的基因紧密连锁的遗传标记在染色体上的位置。 克隆：从定位的染色体区段内分离克隆所要的基因，并进一步研究其功能。,疾病,遗传标记，染色体定位,基因 序列,mRNA cDNA,蛋白质产物 生物学功能,疾病,基因,功能,定位克隆：通过遗传标记 ，先获得某一表型基因在染色体上的定位 ，再在候选区域内选择已知基因 ，进行致病突变的筛选 ，并获得cDNA及全基因。 基本思路是通过连锁分析原理进行基因定位。 若多态标记与待定基因距离较远

8、 ，则它们在向子代传递时会发生自由分离 ，呈“连锁平衡”；反之 ，则不发生自由分离 ，而呈现“共分离”现象 ，即“连锁不平衡”。据此可在染色体上定位与某一DNA标记相连锁的基因。,将基因定位于染色体 特定区段 2. 候选基因筛选鉴定,定位克隆的主要目的之一是将目标基因定位于特定染色体上。 主要方法： 家系调查法 体细胞杂交法 核酸杂交技术 等等,疾病基因分析,问 题,方 法,是否为遗传性状 如果为复杂性状，有无主基因，为显性还是隐性 主基因如何定位 致病基因是否与DNA标记连锁 在患者同胞或亲属间是否存在某些等位基因分布异常 基因的精细定位,家系分析,分离分析,连锁分析,参数分析,等位基因共享

9、法,多位点分析,以家系为基础的连锁分析 family-based linkage analysis,家系连锁分析 ( )法 是以二代或二代以上的家系材料为基础 ，观察标记位点与致病基因位点在家系内是否呈共分离 ，并计算出遗传距离及连锁程度。目前最常用的方法是优势对数计分 ()法 基本概念：连锁、交换、重组 家系调查是古老的遗传学方法，对某一致病基因，收集信息量足够多的家系资料，可以将这一致病基因的表型与一些特定的遗传标记进行连锁分析。,以同胞对为基础的等位基因共占分析。基于观察受累同胞或家系成员间标记位点等位基因的共占情况，即来源于同一祖先的致病基因由受累的亲属共占的机率较随机分布的大 ，包括

10、受累同胞对 ( ，)分析及家系成员()分析,等位基因共占法 Allelesharing method,人群相关分析法的原理是在一定人群中设置患者组和对照组 ，在一组不相关个体中寻找特殊的等位基因标记与疾病表型的关联，在候选致病基因附近选择遗传标记 ，通过观察标记位点与致病基因位点间存在连锁不平衡现象 ，得到某一遗传标记和引起疾病基因关联的相对危险度 ，又称连锁不平衡定位 ( ，)法,以人群为基础的关联分析（association analysis）,A-1型短指（趾）症法 拉比（Farabee）1903年在他的哈佛大学医学院博士毕业论文中首先报道了，即世界上第一例孟德尔常染色体显性遗传病，以后

11、作为遗传学的经典例子被全世界的生物学和遗传学教材广泛引用。,贺林实验室利用布依族、苗族和汉族的三个A-1型短指（趾）症大家系，对该病的致病基因进行了精确定位（位点定在2q35-36区）、克隆，并首次发现了人IHH基因和该基因上的三个突变位点是导致A-1型短指（趾）症的直接原因。,体细胞杂交定位法：,将人类体细胞与小鼠体细胞融合，可以形成杂种细胞，杂种细胞在传代过程中会随机丢失人体细胞的染色体，最后在一株杂种细胞中可能只含有几条或一条人的染色体，或是某条染色体的一部分。利用一套分别包含了人全部染色体的杂种细胞，就可能把某个基因定位于特定染色体上。,用遗传标记进行基因定位,形态标记 morphol

12、ogical markers 细胞标记 cytological markers 生化标记 biochemical markers 分子标记 molecular markers,形态标记 与目标性状紧密连锁，表型上可识别的等位基因突变体 细胞标记 染色体数目和形态结构的变化 生化标记 基因表达产物，如某种蛋白质 的存在与否和分子量大小,分子遗传标记 在核酸分子水平，对具有相对差异的等位基因DNA多态性的标记，广泛存在于高等生物编码区和非编码区，又称为DNA分子标记，是DNA水平上遗传变异的直接反映。,特点: 1. 直接以DNA形式表现，在生物体各发育阶段,各组织均可检测到。 2.数量多，遍及整个

13、基因组。 3.多态性高，自然界存在许多等位突变，无需专门创造特殊的遗传材料 4. 中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无必然连锁 5. 许多分子标记表现为共显性（codominance）, 能够鉴别出纯合基因型与杂 合基因型，提供完整的遗传信息,分子遗传标记发展,RFLP restrict fragment length polymorphism 限制性片段长度多态性 SSLP simple sequence length polymorphism 简单序列长度多态性 SNP single nucleotide polymorphism 单核苷酸多态性,RFLP restrict fragm

14、ent length polymorphism 限制性片段长度多态性分析 指利用限制性内切酶将等位基因DNA切成不同长度片段，这些不同的DNA片段在人群中呈现多态现象，以孟德尔方式遗传。最早用于绘制遗传图。,SSLP simple sequence length polymorphism 简单序列长度多态性 ，又称为VNTR variable number tandem repeat 数目可变的串联重复多态性 指重复单位相对较小,由重复单位的序列差异和数目变化,可形成丰富的多态性。 包括: 小卫星序列 minisatellite 微卫星序列 microsatellite ,小卫星DNA标记 m

15、inisatellite，核心序列为1160bp ，主要存在于染色体靠近端粒处，由于其拷贝数变化，在不同个体间中存在串联数目的差异，若在重复序列两侧有限制性内切酶酶切位点，则切下来的片段会呈现出多态性。可用于DNA 指纹，DNA Finger。,微卫星DNA标记 microsatellite，指以27个碱基为核心单位串联重复而成的一类序列（微卫星DNA microsatellite DNA，又称为STR short tandem repeat 短串联重复序列）,由于核心序列重复数目的变化而在群体中呈现出遗传多态性，但在同一家系内具有高度的遗传保守性，以孟德尔方式遗传。散布于整个基因组中。,SNP single nucleotide polymorphism 单核苷酸多态性，是指在基因组内特定核苷酸位置上存在两种不同碱基，其中最少一种在群体中的频率不小于1。 SNP分为两种形式： 基因编码区的SNP，称为cSNP 遍布于基因组内的大量单碱基变异,SNP分析的特点： （1）SNP数量大，分步密集，平均每1000bp就有一个SNP （2）SNP比STR扩增更有效，不会产生假带 （3）由于SNP是二态的，