《b型流感嗜血杆菌(hib)荚膜多糖(cps)-重组破伤风类毒素c段(rttc)结合疫苗的制备及免疫原性检测》由会员分享，可在线阅读，更多相关《b型流感嗜血杆菌(hib)荚膜多糖(cps)-重组破伤风类毒素c段(rttc)结合疫苗的制备及免疫原性检测（6页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、b 型流感嗜血杆菌( H i b ) 荚膜多糖( C P S ) 一 重组破伤风类毒素C 段( 册C ) 结合疫苗 的制备及免疫原性检测 付作申1花艳红1云国廷1 金贞姬1 伊纯德苏彩霞1 陈尔佳1刘勇2 邵一呜2 1 大连汉信生物制药有限公司，大连，1 1 6 6 0 0 ；2 中国疾病预防控制中心，北京 流感嗜血杆菌( h a e m o p h i l u si n f l u e n z a e ) 是常见的 致病菌，仅对人类至病，分带荚膜菌株和不带荚膜菌 株，荚膜菌株据荚膜多糖的特异性抗原不同分6 个 血清型( a f ) ，其中b 型抗原毒力最大，是d , J L 败血 症、脑膜炎
2、和肺炎的主要致病菌。H i b 荚膜由脂多 糖和荚膜多糖组成，主要成分是核糖基磷酸醇磷酸 盐( p o l y r i b o y l r i b i t o lp h o s p h a t e ，P R P ) ，它的结构包括一 个核糖、一个核糖醇以及一个磷酸碱。 H i b 通过飞沫传播，主要感染5 岁以下儿童。 新生儿通过胎盘传递血清杀菌抗体，从母体获得的 抗体主要存在于六个月以下的婴儿，而2 5 岁的小 儿可产生天然抗体，因而6 。2 岁的J , J L 是H i b 感染 的高峰。 H i b 的血清保护性抗体水平约为0 1 S 倒m l 【2 J ， 儿童对P R P 疫苗的反应
3、与年龄有关，小于1 8 2 4 个 月的儿童根本没有反应，因为P R P 是胸腺非依赖性 抗原 3 ，重复接种也无加强反应，虽然2 岁以上儿童 在接种P 即疫苗后可产生抗体，但维持时间较短， 一年后抗体即降低至相同年龄组对照组的抗体水 平。 以蛋白质为载体的结合疫苗接种儿童，产生的 抗体比单独用P R P 疫苗要高得多，且能维持较长时 间，这些疫苗的基础是通过P R P 多糖与有免疫原性 的蛋白载体以共价键结合，使半抗原变成完全抗原， 从而使非胸腺依赖抗原( T j 鲰) 转变成胸腺依赖抗 原( T d A g ) ，促进T 细胞对B 细胞的作用。T i A g 仅 能激发体液免疫，而T d
4、A g 不仅能激发体液免疫，而 且还能引起细胞免疫，同时产生免疫记忆【4 ，通过抗 原的转变，不仅使小年龄儿童产生加强免疫反应，而 且对再次接种也能产生加强免疫反应，由此提高了 疫苗的保护性能。 目前应用的H i b 结合疫苗的载体主要有四种。 白喉类毒素蛋白为载体的结合疫苗( P R P - d i p h t h e n i a t o x o i d ，P R P - D ) ，以减毒的白喉类毒素C R M l 9 7 为载 体的结合疫苗( h a e m o p h i l u sb o l i g o s a c c a r i c l ec o n j u g a t e H b
5、- O C ) 以B 菌群脑膜炎双球菌胞膜蛋白为载体的 结合疫苗( P R P - o u t e rm e m b r a n ep r o t e i n ，P 脬O M P ) ，以 破伤风类毒素为载体的结合疫苗( P f u P t e t a n u st o x o i d c o n j u g a t e P R P T ) ，其中以破伤风类毒素( ，I f I ) 的结合 是最晚批准上市的，我们国家主要应用，1 1 作为载体 制备细菌类结合疫苗。 r I T I 是由破伤风杆菌( C l o s t r i d i u mt e t a n i ) 合成的一 种分子量约1 5
6、 0 k D 的蛋白质，可降解为A 、B 、C 三 段，其中A 段是毒素的活性部分，B 段起导人作用， c 段的羧基末端与神经节苷脂结合。A 、B 、c 片断中 的任何一种都可作为疫苗，使用，A 、B 、c 片断已成 功地用于免疫小鼠抵抗破伤风 5 6 7 。 以基因重组破伤风类毒素c 片断( r I T E ) 替代 ，I r 作为载体制备细菌类多糖( P S ) 结合疫苗，可以避 免破伤风梭状杆菌培养及脱毒过程的危险性，同时 保持其载体效应；大肠杆菌表达量高，从而降低成 本；P S - r T I E 可作为二价苗。 本实验偿试以r 玳为载体制备H i b 荚膜多糖 ( C P S ) 结
7、合疫苗，还可以建立r T C 为载体的细菌类 多糖结合疫苗的技术平台，为多种菌类结合疫苗的 研制打下基础。 1 材料和方法 1 1 材料 重组破伤风类毒素c 部分( r T T C ) 由本实验用基 因工程方法经纯化获得，b 型流感嗜血杆菌( H i b ) 荚 膜多糖( C P S ) 由兰州生物制品所提供，溴化氰( c ) r a n o g e nb r o m i d e ，C N B r ) 为M e r c k 公司产品，碳二亚胺 1 - e t h y l 3 一( 3 - d i m e t h y l a m i n o p r o p y l ) c a r b o d i
8、 i m i d e ， E D A C ，S i g m a 公司产品。1 ，6 已二酰肼( a d i p i ca c i d d i h y d r a z i d e ，A D H ) S i g m a 公司生产。辣要过氧化物酶 ( H R P ) 标记羊抗兔、羊抗鼠、马抗兔B D 公司产品。 S e p h a c r y lS - 1 0 0H i g hR e s o l u t i o n 凝胶为A m e r s h a m 公 司产品。 1 2 方法 1 2 1C P S 与r T I C 的偶联 4 7 122 f I 孳A I I I 衔牛物的刺备取冻1 1 5 用
9、 蒸俏啦按1 0m g 1 0m l 比例磁J J 搅拦器搅拌完仑溶 解，05m ”l LN a J I 垌I ) f 【节1 08 ，审批条什1 - 持续搅拌 人L N 岛I 约5 m g ) 保持r I1 08 2 0m 后川0f 舢f ，I I I C I 耐【I f 董9 ) 按摩尔比J ：3 加 入A l i t ，州l 至85 窜泓压心1 5m i n 4 t ，磁九搅 拌器 虻拌I2h ，反t I 液髓J00 5n l LN a c I 中透 析1 2h ，每艄3h 襁逢析液状，透析后厦啦液进 人 F 步箩；骑或豇争t 4r 一7 0 1 ：保存备用 123C P S 1r r
10、F I r 的偶联：C P S - A D H 衔生物f J 按I3 廊啦比枷人一1 I I OI lH C I i Z tn H 值争 57 磁力艋拌器搅拌r j ：| | 】八E D i t ( 终旅噬0I I n “ w 1 4 T 眨l 一：，6 1 m i n 州p i t 随69 终止反f i ， 5 0 0 0K I 】超滤离t 铃超弛淋缔i 州肇上求反啦的小分 r 物胍7 0 t 增、抒备H 】或l F 少l 互臆 I2 4C 1 一r l I C 似联产物的纯化1 ，r y lS 1 0 0H I 曲R e 钟l u t i o i t 龃腔f l ：分随 2 1 5 t ：
11、l n 收集v u 附近峰液，1 0 0K I 翅滤离心符浓缩井击除缓冲渡 中的盐类物质02 1 咖滤膛廿滤除荫真夺非十， 7 0 保存备用 I25C P S - ( I + f C 生物活性检测：w f ，l 【h n E 法，埚华兰生物公司产破伤风类嚣 者( r r ) 抗体n 为 抗H R P 标址的羊抗玛抗体协涮C P S 。i l I Ct ，r l I C 生物活性“B c 公耐1 ；钭流感嗜I 札轩尚免抗m 清，埘免痤取扩散方法榆删C J T J - r T ；纯化，“物t ， 打。i 物活性 I26 s - 州多抗制备 I26l 兔多抗的制备小鼠免疫原惟宴验 弗瞳水完全佐荆(
12、F I A ) 制箭：羊毛脂l O E ，运滴 加入忧礁打蜡油劬n d ，边滴边研脯分装，商I j ：灭菌 后4 保存备用 弗氏完全佐荆乳化抗娘的制备：将F I A6 0 m i nf 温按F L j tB C I ；( p 介血7 5 m g J m lJC P S - 】甲r c ( 24 m g m 1 ) ：3 ：05 ：25 比例舒j ；I j 加入一灭菌5 0 m l 离心管用+ 次1 5 n di ：射器舢吸，直至开；啦均性 的乳状液，取滴十冷水面J ：水散J f ：为合格。 选用健康成年雄性家免体重2 k g 左右第次 和第二次采用皮F “ A 电( I f 后，背、颈六点，腔
13、股沟两 点) 洼g 十免疫，每点02 m 1 第= 次耳静脉注射，饵次 免疫l 训隔l t , i l i i J1 4 d i 免疫双扩梭侧抗体敏价颈动 脉放m 【m 清分离后加入建氮钠和甘油2 0 侏存缶 川 I262 小鼠免嫂川冲盘删 小鼠免疫原性丰J J 步雪；脑：缚缉l oH 雄性昆明小 4 R 鼠分别j 艘伤风噬l ；| I 疫曲旗H 畦目lJ “物r l n ：葛 1 素生范h 删沲感嗜血轩陌智一台投陌C P S 丌和 ( 鼍f F F C 鸺联J “物免碴小鼠，破1 ，j m 暇附痉曲刊坶 兰索一史克 ) 铡洫感哺粗轩菌结合疫衙C P S T r j 月j 玻欹免疫f 0 兵小
14、鼠，几和C P S - I T C 隅联，“ 物每F 小鼠每次纪疫25 腭，免疫二次，问龋2 削，最 焉一次2 删后服球取血，分离血清后，测定抗体教 价，其余抗血清加入叠氨钠2 0 保存备I i i i j 。 2 结果和分析 2 1I i t h 荚膜多糖c P s ) 分子的测定 由军事蹦学科学院仪器中心艟带室完成，结果 表明：1 1 州1 物制品所提供的H i bc P s 分千量在c ) 7 1K t J a ( 结精见闱l B 捌i 】 怂嗜蜘杆茁英膜多特魁 由俊槠琏核盼醇磷艘盐L P R P ) 。弘悼聚赍而成，第1 、 单体P R ，分J ，f I f 匀3 6 8 可见率寅骑所
15、用多槲为2 3 个币悼聚m i 成 圈I b m 质谮分子量测定结果 2 2C P S 与l r r c 的偶联及产物纯化 取c I 鼍i r 阢偶联产物经趔滤离心许趣滤浓缩 并所04 1 m ，滤膜际甜和较大分子杂质用S e p h e r y l 凝歧对其纯化，蛋白紫外主辱吸收峰为2 8 0 n m ，C P S t 要吸收蜂为2 0 6 m 田圈2z 以看L I ，V O 蟑处 2 8 0 衅刊2 6 6 峰青有吸收蜕明c P s 与( I r C 偶联址 成功的收舣C P S r T I C 偶联产物凝胶层析后v o 峰 ( 罔2 j 样 “经5 K D 超滤离管趟滤浓缩后进入下一 步实骑或冻I ：备用 2 3 偶联产物生物活性检测 以内制f 几免抗血清埘C P S - F P I E 纯化产物钉 免嫂印缱( I P mB l o t t i n g ) ( 图3 ) 结果表明，经纯化 后，偶联产物巾，几具有生物活性 以B D 公r db 型流赌嗜血轩i 挚f 兔多抗肘纯化后 C P S , T I C 倡联产物行免疫瑕扩实验( 斟4 ) ，结粜丧 明纯化c | 孽d 代偶联产物中【：P s 具有良好的生物 活性； ：警器嚣：器： ：落器5 0 4 1
