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1、西北大学硕士学位论文答辩,基于磁性微粒和荧光微球的DNA 检测方法研究,答辩人：姚敏杰 专 业：分子微生物学 导 师：陈 超 教授 崔亚丽 教授,西北大学生命科学学院 2007-05,西北大学硕士学位论文答辩,2,目录,综述 研究报告 实验一 基于磁性微粒的DNA杂交检测 实验二 荧光微球用于人乳头瘤病毒的基 因分型研究 全文总结,目前现有的固相核酸杂交检测方法 杂交基本原理 本研究的意义,西北大学硕士学位论文答辩,3,1.目前现有的固相核酸杂交检测方法,综述,西北大学硕士学位论文答辩,4,磁性微粒技术,磁性微粒的研究始于上世纪70年代，它除具有纳米颗粒的特征外，还可以通过表面的功能基团进行修
2、饰，共价偶联蛋白、核酸等有机/生物分子， 并且具有顺磁性，可在外加磁场的作用下快速移动和分离而广泛应用于免疫学检测、靶向载药、细胞分选、酶的固定化以及分子生物学（DNA和RNA的测序与纯化）等领域中。,技术优势,灵敏度高、特异性强 实用性、操作性强 仪器设备简单、省时省力,西北大学硕士学位论文答辩,5,荧光微球技术,液态悬浮芯片技术是指一项将核苷酸、抗原、抗体、受体、肽链及酶底物等生物大分子结合在荧光微球表面，根据生物测定的原理，与待测样品中的相应物质发生特异性反应，然后借助流式细胞仪对检测结果进行实时定量化分析的技术。,技术优势,高通量、快速分析 高特异性、高精确性、高灵敏度 省时、省力、经
3、济,液态悬浮基因芯片仪器照片,西北大学硕士学位论文答辩,6,2.杂交基本原理,固相直接杂交检测原理示意图,7,单碱基链延伸反应检测SNP基因型的示意图,单碱基链延伸反应的原理,引物,西北大学硕士学位论文答辩,8,本研究的意义,有助于建立经济、快速的DNA固相检测方法 有助于高通量、高灵敏度、高特异性和自动化的DNA 检测方法的建立 有助于对遗传疾病、肿瘤、传染病等的迅速诊断，有 助于司法部门对罪犯的鉴别、性别鉴别、器官或组织 移植的配型等领域的研究与应用,西北大学硕士学位论文答辩,9,实验一 基于磁性微粒的DNA杂交检测,实验原理 探针与磁性微粒的偶联 靶片段的扩增 单碱基链延伸 荧光信号的引
4、入以及结果的读取 实验小结,研究报告,10,检测原理示意图,实验原理,A：jingwen Chen 等检测SNP原理示意图1,B：本研究设计原理示意图,1 jing wen Chen, Marie A. lannone et al. A Microsphere-Based Assay for Multiplexed Single Nucleotide Polymorphism Analysis Using Single Base Chain Extension J.Genome Research.2000,10:549-557,11,探针与磁性微粒的偶联,探针在不同磁性微粒表面的偶联示意图,A
5、：羧基末端磁性微粒 B：氨基末端磁性微粒 C：环氧乙烷磁性微粒,西北大学硕士学位论文答辩,12,磁性微粒的优选,磁性微粒的种类,羧基末端磁性微粒、氨基末端磁性微粒、环氧乙烷磁性微粒、Dynal磁性微粒,优选内容,探针在磁性微粒表面最大偶联量 探针在磁性微粒表面的偶联效率 经过热处理后探针在磁性微粒表面的损失量 探针在磁性微粒表面偶联所用时间 选用材料的价格,96 5 min 5 min+5个循环 5 min+10个循环 5 min+20个循环 5 min+30个循环,13,磁性微粒优选结果,1.最大偶联量和偶联效率,2.经过热处理后探针在磁性微粒表面的损失量,西北大学硕士学位论文答辩,14,3
6、.其它因素对磁性微粒优选的影响,最终选取羧基末端磁性微粒进行后续研究,西北大学硕士学位论文答辩,15,靶片段的扩增,不对称PCR扩增反应体系与扩增条件,16,不对称PCR扩增上下游引物浓度的摸索,西北大学硕士学位论文答辩,17,不对称扩增PCR产物与固定有探针的磁性微粒的杂交反应及单碱基链延伸反应,18,荧光信号的引入和结果的读取,洗涤条件的优化 分别用1PBST洗涤4次、2次、1次选取最佳结果,洗涤条件的优化结果,西北大学硕士学位论文答辩,19,氨基标记探针溶液在羧基末端磁性 微粒表面偶联前后的紫外吸收曲线,偶联结果,E.Coli不对称PCR扩增结果,不对称PCR扩增结果,西北大学硕士学位论
7、文答辩,20,最终检测结果,西北大学硕士学位论文答辩,21,实验小结,基于单碱基链延伸反应原理初步建立了DNA杂交检测的方法。在检测大肠杆菌待测核酸DNA时，获取阳性信号是对照组的21倍。证明该方法用于DNA杂交检测的可行性、特异性和准确性。 对4种不同的磁性微粒进行筛选，初选出与探针偶联效率高、偶联量高而稳定、磁性微粒可经过长时间高温处理且表面修饰的功能基团损失较少的磁性微粒。 3. 利用不对称PCR扩增产生一定量单链PCR产物，免除了用NaOH处理PCR产物以便双链DNA变为单链的步骤，简化了杂交反应操作和缩短了时间，增大了杂交检测法的实用性。,西北大学硕士学位论文答辩,22,实验二 荧光
8、微球用于人乳头瘤病毒的基因分型研究,人乳头瘤病毒简介 实验原理 探针与荧光微球的偶联 靶片段的扩增 扩增产物与偶联有探针的荧光微球进行杂交 基因分型方法的建立 实验小结,西北大学硕士学位论文答辩,23,人乳头瘤病毒简介,人乳头瘤病毒是乳多空病毒科乳头瘤病毒属的一个双链环状DNA病毒，其颗粒呈球形，呈二十面体对称，直径约4555 nm，分子长度约为7.88 kb。,HPV感染的潜伏期长，不易在体外培养。因此，目前对HPV 感染的分型诊断，主要依赖分子生物学手段对病毒DNA检测。现有的检测方法对操作人员技术水平要求高，试剂昂贵；所需临床标本量大，甚至还需对临床标本多次扩增及多次分离分析，整个过程颇
9、为复杂。因此，对HPV进行早期、快速检测和型别鉴定具有重要的临床意义。,主要感染上皮组织，显示高度的宿主特异性，对人体特异部位的上皮细胞具亲和力。通过人体间密切接触传播，可引起寻常疣，尖锐湿疣，宫颈癌等疾病。迄今已发现有120余型HPV。,24,分型依据及实验原理,检测原理示意图,HPV的分型主要根据其基因组的同源性不同进行分型，作为新的一型HPV，其基因组可被完全克隆，L1、E6 及E7开放阅读框与其它型基因组比较，具有低于90%的同源性。,分型依据,探针 研究发现，在外阴、宫颈部位，感染HPV最常见的低危类型有HPV6，HPV11和HPV53；高危类型有HPV16，HPV18，HPV31，
10、HPV33，HPV35，HPV45，HPV51，HPV52，HPV53，HPV56，HPV58等，这些类型占外生殖器部位感染类型的96%左右。 选择的探针参考M.V.JACOBS 2设计。通过使用美国NCBI数据库做BLAST比对研究，结果每一型探针与其它型HPV间未出现型间交叉相互干扰的现象。,2 Dunbar, S.A. and J.W. Jacobson. Application of the Luminex LabMAP in rapid screening for mutations in the cystic fibrosis transmembrane conductance r
11、egulator gene: A pilot study. Clinical ChemistryJ.2000,46:1498-1500.,探针与荧光微球的偶联,西北大学硕士学位论文答辩,26,所有探针5端均采用NH2-C14修饰，以便与荧光微球偶联。探针由三博远志生物技术有限公司合成。,3M. V. JACOBS, A. M. DE RODA HUSMAN, A. J. C. VAN DEN BRULE, P. J. F, et al. Group-Specific Differentiation between High- and Low-Risk Human Papillomavirus
12、Genotypes by General Primer-Mediated PCR and Two Cocktails of Oligonucleotide ProbesJ. CLIN. MICROBIOL. 1995, 33(4): 901-905,西北大学硕士学位论文答辩,27,靶片段的扩增,西北大学硕士学位论文答辩,28,扩增结果,HPV质粒PCR扩增结果,100 bp,250 bp,M：DL2000；1：PCR空白对照；2：HPV 18；3：HPV 31；4：HPV35 （上样量均为：5 LPCR产物+1 L 10loading buffer）,29,检测结果,西北大学硕士学位论文答辩,
13、30,实验小结,以液态悬浮基因芯片为技术平台，初步建立HPV DNA杂交检测分型的方法。本方法选取的3种型特异性探针以共价键分别偶联至3种不同的荧光微球，表面探针密度高，产生信号强，同时荧光检测使信号进一步得到放大，所以敏感性大大提高，实验结果显示杂交值/未杂交值最高可达近百倍，最低也有8倍以上。 3种荧光微球探针对应的标准品PCR产物具有特异性的杂交反应，彼此间并不相互干扰，对于产物中单一型HPV存在的情况下，根据所对应荧光信号对待测DNA进行确定，可100的分析出HPV型别。 3. 杂交过程在悬浮的液相中进行，杂交后不用清洗就可以直接读数，检测效率远远高于固相杂交，所用时间从几小时缩短到3
14、0分钟，快速、可靠、操作简便。并且临床检测中使用通用引物，仅需一次PCR扩增即可检测3种最常见的高危型HPV，既提高了检测的通量，也大大降低了临床标本的用量。,西北大学硕士学位论文答辩,31,全文总结,1.本文利用液态悬浮的羧基末端磁性微粒和液态荧光微球为载体，构建了杂交检 测DNA的新方法，具有操作简便、省时省力、经济实用、结果判别准确等特 点。 2.以羧基末端磁性微粒构建的DNA检测方法，每毫克磁性微粒表面最大可偶联针 0.65 nmol，偶联效率可达97.60，根据单碱基链延伸原理的检测点是空白点荧 光强度的21倍，证明该反应体系的正确性与可靠性。在外加磁场的作用下很容易 与未杂交的核酸
15、或探针分离，大大简化了操作步骤，为进一步检测节约时间。 3.以荧光微球为技术平台建立的方法，所选取的3种型特异性探针以共价键分别偶 联至3种不同的荧光微球，实验结果显示杂交值/未杂交值最高可达近百倍，最低 也有8倍以上。杂交过程在悬浮的液相中进行，杂交后不用清洗就可以直接读数 ，检测效率远远高于固相杂交，所用时间缩短至30分钟，快速、可靠、操作简 便。,致谢,感谢我的导师陈超教授在我硕士学习期间给我创造了难 得的实验技术平台和良好的实验环境以及对我的生活的 关心，在此我谨向陈老师表示最衷心的感谢和深深的敬 意！ 感谢崔亚丽教授在实验以及论文的完成方面给予的悉心 指导和无私的帮助！ 感谢国家微检测系统工程技术研究中心的董兆麟教授、 但宁博士、李铮教授、朱娟莉老师、彭明丽博士在实验 过程中的耐心指导和帮助！ 感谢实验室全体工作人员和同学在实验中对于的技术帮 助、合作、理解和支持！ 感谢在我三年的学习生活中任何给予我关心和帮助的人！,
