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1、第四章 代谢控制发酵 育种的基本技术,代谢控制发酵课程,授课教师：张 侠,要控制微生物的代谢作用，就是要控制培养条件和微生物的遗传型。改变微生物的遗传型往往是控制代谢的最有效途径。 方法包括培育有遗传标记的突变株，或将目的产物基因进行克隆而加以扩增。 要获得有目的遗传标记的突变株，常采用诱变或细胞内基因重组等育种技术。,诱变育种：利用物理或化学因素处理微生物细胞群体，促使其中少数细胞中的遗传物质（DNA）的结构发生改变，从而引起微生物的遗传性状发生变化，然后通过目的选择标记设法从群体中筛选出少数性状优良的突变菌株的过程。 诱变技术操作简便，收效显著，因此应用非常广泛，是代谢控制发酵育种中最基本
2、的技术。,第一节 诱变,微 生 物 诱 变 育 种 的 程 序,一、诱变剂,突变：生物出现与亲代不同的遗传性状的现象，即生物体的表型发生了可遗传的变化，其本质是生物体的遗传物质（DNA或RNA）中的核苷酸序列发生了稳定、可遗传的变化。 凡是能够显著地提高突变频率的理化因素均可称为诱变剂。 常用的诱变剂可分为物理诱变剂和化学诱变剂。,物理诱变剂 物理诱变剂对微生物的诱变作用主要是由高能辐射导致生物系统损伤，继而发生遗传变异的一系列复杂的连锁反应过程。 物理诱变因素很多，有非电离辐射类的紫外线、激光和离子束等，能够引起电离辐射的X射线、-射线和快中子等。 近年的新型诱变剂有微波、红外射线、激光、高
3、能电子流等。,化学诱变剂 在选择有效化学诱变剂的工作中，已经试验过几千种化学物质，发现从简单的无机物到复杂的有机物都有许多具有诱变作用的物质，如金属离子、一般化学试剂、生物碱、代谢拮抗物、生长激素、抗菌素、高分子化合物、药剂、农药、灭菌剂、染料等。 化学诱变剂都具有毒性，其中90%以上是致癌物质或极毒药品，使用时要格外小心，避免与皮肤直接接触，也要防止污染环境。,1、紫外线 紫外线是一种使用方便且诱变效果较好的物理诱变剂。紫外线的波长为136390nm，其中波长为260nm的紫外线杀菌能力最强。人工制作的紫外灯发出的253.7nm的紫外线杀菌能力强而且稳定，诱变效果良好。 胸腺嘧啶二聚体的形成
4、是紫外线改变DNA分子结构及生物活性的主要途径。 紫外线对生物体具有杀菌和诱变双重生物学效应。,紫外诱变操作：比较简单，在诱变箱内，边进行紫外照射边搅拌细胞悬液即可。 注意事项： 为了避免光复活作用，照射过程及照射后操作必须在暗处或红光下进行； 紫外诱变不受温度影响，可在室温下进行； 最好安装稳压电源器； 操作时注意防护（皮肤、角膜）。,2、亚硝酸 亚硝酸能使碱基氧化脱氨，结果使AH，CU，GX，从而改变了碱基的配对关系，引起突变。 G脱氨后成为X，X是一种无意义的碱基，不能同任何一种其它碱基配对。因此，这种变化只能导致细胞死亡，而不能期望它会诱发突变。 亚硝酸极不稳定，易分解，易挥发。因此，
5、需要在临用前将NaNO2在pH4.5醋酸缓冲溶液中生成HNO2。诱变后，应用大量水稀释终止亚硝酸作用。,生物学上的烷化剂是指在正常的生理条件下，能将其烷基转移给重要生物大分子的一类化合物。 烷化剂能够与DNA分子的许多部位发生作用，结果使DNA分子增加了烷基侧链，从而改变了DNA的分子结构，这就是烷化剂引起生物体发生突变的主要原因。 在烷化剂中最常用的是硫酸二乙酯（DES）和亚硝基胍（NTG）。,3、烷化剂,烷化剂的某些性质,菌种选育常用的诱变剂,二、诱变育种中的几个问题,诱变育种工作量大，周期长，对一般周期为7-10d的抗生素菌种来说，一代诱变需要2-3个月。 具体要选育怎样的菌种，在诱变育
6、种前，应该对生产的设备和工艺有相当的知识和全面了解。如现有菌种的生产能力，菌种适应情况，现有生产设备结构等，新菌种能否达到缩短周期，发酵低热，降低成本等等。,诱变育种的主要环节是： 以合适的诱变剂处理大量分散的微生物细胞悬浮液（细胞或孢子），在引起绝大多数细胞致死的同时，使存活个体中的变异频率大大提高。 设计一种有效的筛选方法淘汰负变株，并把正突变株中少数变异幅度最大的具有优良性状的菌株巧妙地挑选出来。,1、出发菌株的选择,菌种可以从以下几个途径进行收集和筛选：,工业上用来诱发变异的菌株，称为出发菌株。 出发菌株通常有三种： 从自然界分离得到的野生型菌株：对诱变剂敏感，易发生变异，容易产生正突
7、变。 由自发突变经筛选得到的菌株：也属于野生型菌株，在生产中使用的，具有一定生产能力，容易收到较好的效果。 已经诱变过的菌株：较为复杂，常用回复突变或经基因重组后再作为诱变育种的出发菌株。,选择易于表现出基因发生改变的单倍体细胞。 选择纯种、单核或细胞核尽量少的细胞：在混有野生型和突变型的异核体中，可能出现分离性表型延迟现象；如在霉菌诱变育种中，多采用分生孢子或孢子囊孢子进行诱变处理。 选择出发菌株应考虑其稳定性。 大幅度提高产量是经过多次诱变、筛选的结果。,2、菌龄 一般处理细菌的营养细胞，采用生长最旺盛的对数期，孢子或菌株要年轻、健壮，其变异率较高且重现性好。 霉菌和放线菌一般处理它们的孢
8、子。处理时力求孢子处于活跃状态，即最好采用刚刚成熟时的孢子，其变异率高。如在处理前事先将孢子培养数小时，使其脱离静止状态，则诱变率也会增加。,一般采用生理状态一致（用选择法或诱导法使微生物同步生长）的单细胞或孢子进行处理。 处理前细胞尽可能达到同步生长状态，细胞悬浮液经玻璃珠振荡打散，并用脱脂棉或滤纸过滤，以达到单细胞状态。对于酵母等个体较大的细胞，可换用二层擦镜纸过滤，经此处理，分散度可达90%以上，供诱变处理较为合适。 霉菌和放线菌采用孢子悬浮液进行诱变。,3、菌悬液的制备,根据选用的诱变剂不同，菌悬液可用生理盐水或缓冲液配制。 用物理诱变剂处理时，一般用生理盐水（NaCl 0.85%）配
9、制悬浮液即可。 用化学诱变剂处理时，必须采用缓冲溶液。,4、菌悬液的浓度 一般处理真菌的孢子或酵母时，其悬浮液的浓度大约为106个/ml，细菌和放线菌孢子的浓度大约为108个/ml。 悬浮液中的细胞可采用平板活菌计数法、光密度法（OD值）、血球计数法（酵母菌和真菌的孢子）和电子计数器法测定。 由于总菌数与活菌数间差异很大，所以最好以测定活菌数为标准。,5、前培养 处理前将细胞培养在补给了嘌呤、嘧啶等碱基或酵母膏培养基中2060min，再进行诱变处理，则变异率可大幅度地提高。,前培养,6、诱变剂及其剂量的选择 选择专一性比较强的诱变剂。 在具体工作中，多用营养缺陷型的回复突变、抗药性突变（最为方
10、便）、形态突变和溶源性细菌的裂解等方法作为筛选诱变剂诱变效应强弱的指标。 目前在实际育种中仍采用NTG和EMS等化学诱变剂。但由于多数是引起碱基对转换，得到的突变株的回复变率高，是一大缺点。,一切诱变剂都具有杀菌和诱变双重效应。 当细胞存活率较高时，突变率往往随着诱变剂量的增加而增大，当达到某一数值时，突变率反而降低。这说明在诱变剂的使用中存在着最适剂量。 近来认为，杀菌率在70%80%或更低剂量，诱变效果好，特别是经多次诱变后的高产菌株更是如此。,经验认为，经长期诱变后的高产菌株，以采用低剂量处理为妥； 对遗传性状不太稳定的菌株，宜用较温和的诱变剂和较低剂量处理，因为对这样的菌株，仅要求能达
11、到发酵单位有所提高就可以了； 当选育目的是筛选到具有特殊性状的菌株，或较大幅度提高产量的菌株，可用强的诱变剂和高剂量处理，使基因重排后发生较大变异，容易出现新特性或产量有突破性提高的变异菌株。,7、中间培养 突变基因的出现并不意味着突变表型的出现，表型的改变落后于基因型改变的现象，称为表型延迟。 为了克服表型延迟，必须将经诱变处理的菌液进行中间培养，即将一定量的菌液接入完全液体培养基中培养过夜。,将处理过的细胞转移到营养丰富的培养基中进行培养，使突变基因稳定、纯合并表达。 遗传物质经诱变处理后发生的改变，必须经过DNA的复制才能稳定成突变基因，而突变基因则要经过转录和蛋白质的合成才能表达，呈现
12、突变型表型。 诱变后的一个小时内必须进行新的蛋白质合成，变异才有效。,诱变育种程序,三、突变型菌株的分离,通过诱变处理，在微生物群体中会出现各种突变型的个体，但其中多数是负变体。为在短时间内获得良好的效果，应该努力设计和采用效率较高的筛选方案及筛选方法。 实际工作中，一般分初筛与复筛两个阶段进行，前者以量（选用菌株数量）为主，后者以质（测定数据的精度）为主。,1、初筛,根据形态变异淘汰低产菌株。 在某些菌落形态与生产性能有相关性的情况下，可以采取在平皿上直接筛选。 根据平皿生化反应直接挑取高产菌株。 常用的有纸片培养显色法，透明圈法，琼脂片法，浓度梯度法等。,菌体初筛：是从分离得到的大量菌种中
13、将合成目的产物的菌种筛选出来的过程。初筛可分为平板筛选（粗放）和摇瓶发酵筛选（效果较一致）。,利用蛋白酶水解圈、淀粉酶变色圈、纤维素水解圈等, 采用冷敏感菌筛选抗生素； 浓度梯度法； 应用复印及快速筛选突变体； 琼脂块法筛选突变株。,琼脂块法预筛流程图,琼脂块法预筛 琼脂块制备：在直径9cm平皿中定量加入30mL基础培养基，冷却凝固后用直径6mm打孔器打好琼脂块，然后用竹签把琼脂块移至直径9cm空平皿中； 单菌落点接琼脂块和培养：挑取型菌落，或形态变异明显的菌落，点接到琼脂块上。每次诱变最少挑200株。把以上平皿置于保湿盒内，28培养2d，使活性物质积累于琼脂块中； 琼脂块生测：把培养好的琼脂
14、块移到生测平板上，28培养2d，测量抑菌圈直径。每生测平板挑取抑菌圈最大的菌落23个，接种斜面，每次诱变最少挑50株。,平板菌落预筛,初筛用摇瓶发酵培养，不仅要花费大量的人力物力，而且筛选周期长，限制了筛选数量，降低了高产突变株的获得几率。 平板菌落预筛是初筛工作的一部分。 从分离平板上挑取菌落进行平板菌落预筛，弃去大量低产菌株，保留其中10%移入试管斜面，再对它们进行摇瓶筛选。才能逐步筛选出高产菌株。,2、复 筛,复筛是指对突变株的生产性能做比较精细的测定，需要对突变株发酵培养基的组成、种子培养、接种量、培养温度、培养时间等参数进行精确地测定，找出最佳发酵条件，以便放大。 诱变育种实例：纳豆
15、杆菌的诱变育种； 阿维链霉菌诱变育种,大瓶复发酵复筛 用初筛出的58株菌成熟斜面孢子接种于装有100mL种子培养基的500mL三角瓶，200r/min，28 培养48 h，得种子液。取种子液10mL接种于装有80mL发酵培养基的500mL三角瓶中，200r/min，28培养96h。复发酵复筛3批次，每次每株重复接种3瓶。用HPLC法测定发酵液目的代谢产物的含量，筛选出24株产量高的变异菌株用于下一轮诱变处理和菌种保藏。,营养缺陷型是属代谢障碍突变株，常由结构基因突变引起合成代谢中一个酶失活直接使某个生化反应发生遗传性障碍，使菌株丧失合成某种物质的能力，导致该菌株在培养基中不添加这种物质，就无法
16、生长。但是缺陷型菌株常常会使发生障碍的前一步的中间代谢产物得到累积，这就成为利用营养缺陷型菌株进行工业发酵来累积有用的中间代谢产物的依据。,3、营养缺陷型 auxotroph,几个概念 营养缺陷型（auxotroph）：经诱变产生的一些合成能力出现缺陷、而必须在培养基内加入相应有机养分才能正常生长的变异菌株。 野生型(wild type)：自然界分离到的任何微生物，在其发生营养缺陷突变前的原始菌株，为该微生物的野生型。 原养型 (prototroph) ：指auxo突变菌株回复突变或重组后产生的菌株，与野生型的表型相同。,筛选用的培养基 基本培养基（minimal medium, MM）- ：满足野生型菌株营养要求最低成分的组合。 完全培养基（complete medium, CM）+ ：满足一切auxo生长的天然或半组合培养基。 补充培养基（supplemented medium, SM）x ：在MM中有针对性地加入一或几种营养成分以满足相应 auxo生长的组合培养基。,用于诱发营养缺陷型的诱变剂有亚硝基胍
