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1、1紫杉醇脂质体节奏性化疗对胃癌乏氧影响的实验研究作者：郑勇斌，童仕伦， 赫杰，马书进 【摘要】 目的 利用乏氧显像监测紫杉醇脂质体节奏性化疗过程中胃癌的乏氧变化。 方法36 只荷人胃癌 HS-746T 细胞的雄性裸鼠（46 周）随机分成两组，治疗组按 5mg/kg 的剂量每 3 天一次行腹腔内注射紫杉醇脂质体，对照组注射同体积的生理盐水。治疗后第 2d 和 14d 利用 SPECT 全身静态扫描显示注射 99mTc-HL91 后 5，10，15，30，60，120 和 180min 的显像。在显像上标记感兴趣区为靶点，计算各组靶/非靶比值。然后处死裸鼠、切下肿瘤行称重和放射性计数。通过免疫组织
2、化学染色检测 CD34 表达，计算肿瘤微血管密度（MVD） 。 结果 治疗后第 2d，紫杉醇脂质体治疗组 T/NT 低于对照组（7.820.28 vs. 9.560.31，P0.05） ，离体肿瘤放射性滞留降低（0.710.03 vs. 0.970.03，P0.05） ，MVD 降低（42.892.63 vs. 52.783.09，P0.05） ；治疗后第 14d，治疗组 T/NT 高于对照组（11.540.42 vs. 9.960.28，P0.05） ，离体肿瘤放射性滞留升高（1.420.05 vs. 11.540.42，P0.05） ，MVD 明显降低（27.892.51 vs. 66.1
3、12.83，P0.001） 。 结论 治疗初期紫杉醇脂质体降低胃癌乏氧，后期乏氧增加，乏氧监测对胃癌的治疗有一定的指导意义。 【关键词】 胃癌细胞Experimental Study of Effects of Metronomic Chemotherapy with Paclitaxel-Liposomes on Gastric Cancer HypoxiaAbstract: Purpose To monitor the hypoxic change of gastric cancer during metronomic chemotherapy with paclitaxel-liposo
4、mes by the hypoxia imaging. Methods Thirty-six male nude mice bearing human gastric cancer HS-746T cells were randomly divided into two groups: The treatment group received paclitaxel-liposomes at a dose of 5mg/kg intraperitoneally and control group received the same volume of saline in every three
5、days. On 2 and 14 days, all the mice underwent static whole body planar imaging with SPECT at 5, 10, 15, 30, 60, 120 and 180 minutes after injection of 99mTc-HL91. Region of interest, ROI were drawn as the target in planar imagines and target-to-non targeted (T/NT) were calculated. Then the mice wer
6、e sacrificed and the tumors were removed, weighted and the radioactivities were measured. CD34 expressions were detected by immunohistochemical staining and microvascular densities (MVD) of the tumors were calculated. Results On the second days after paclitaxel-liposomes treatment, T/NT ratio of tre
7、atment group was significantly lesser than that of control group（7.820.28 vs. 9.560.31, P0.05）, the radioactive 2retention and the MVDs of isolated tumor tissues in the treatment group were lesser than those of control （0.710.03 vs. 0.970.03,P0.05） （42.892.63 vs. 52.783.09,P0.05）. On 14 days after t
8、reatment, T/NT ratio and the radioactive retention of treatment group were significantly higher than those of control group （11.540.42 vs. 9.960.28,P0.05） （1.420.05 vs. 11.540.42,P0.05）. The MVD of isolated tumor tissues in the treatment group was significantly lesser than that in control（27.892.51
9、vs. 66.112.83,P90%。1.3 主要仪器美国 GE 公司的 Discovery VH 型符合线路 SPECT，配置针孔准直器。科大创新股份有限公司的 GC-1200 放射免疫计数器。1.4 实验动物346 周龄雄性裸鼠 Balb/c 36 只，体重 18g20g，由武汉大学人民医院实验动物中心提供，并在该中心 SPF（specific pathogen free）条件下饲养。1.5 实验方法1.5.1 人 HS-746T 细胞培养与单细胞悬液的制备含 10%小牛血清的 RPMI-1640，37，5%CO2 孵箱培养，每 12d 换液 1 次，34d 后可长成单层细胞，每 3d 传
10、代 1 次。取对数生长期细胞，生理盐水配制成单细胞悬液，台盼蓝（trypan blue）染色，活细胞95%，生理盐水将细胞浓度调整到 1108/ml。 1.5.2 荷人 HS-746T 细胞的裸鼠异种移植模型的建立及治疗方法裸鼠双前肢皮下分别用 1ml 的微量注射器，注射 HS-746T 单细胞悬液200l，2 周后，肿瘤长径至 2mm5mm 时，随机将裸鼠分成 4 组（每组 n=9）：1、3 为治疗组，按 5mg/kg 腹腔注射紫杉醇脂质体，2、4 为对照组，腹腔注射同体积的生理盐水；两组均为每 3 天注射 1 次，连续使用 2 周。1、2 组于初次治疗后第 2d，3、4 组于治疗后第 14
11、d 测量肿瘤乏氧和微血管密度（MVD） 。1.5.3 99mTc-HL91 荷瘤裸鼠全身显像裸鼠腹腔注射 20%乌拉坦(800mg/kg1 000mg/kg)麻醉，仰卧固定，经尾静脉注射 99mTc-HL91 37MBq(1mCi)，以 SPECT GE Millenium VG 仪采集注射后5min、10min、15min、30min、1h、2h、3h 荷瘤裸鼠全身静态后位平面图像。采集条件：针孔准直器，256256 矩阵，放大倍数 4.0，采集时间 10min。在荷瘤裸鼠 99mTc-HL91 显像图像上勾画肿瘤和下肢的感兴趣区（ROI） ，测量各 ROI 内平均放射性计数，计算出靶和非靶
12、组织放射性比值(T/NT)。取 3h 的显影的 T/NT比值代表组织乏氧状态，测定各组肿瘤的乏氧情况。离体肿瘤组织放射性分析：裸鼠全身乏氧显像 3h 后处死裸鼠，剥离肿瘤组织，称重，测量放射性计数1。1.5.4 免疫组织化学染色及结果判断肿瘤组织于 10%多聚甲醛中固定，石蜡包埋，连续切片（4m） ，CD34 免疫组织化学染色。采用 S-P 法，按试剂盒说明逐步操作。各组标本同一批染色，以PBS 代替一抗作阴性对照。按照 Weidner2标准计算 MVD。1.6 统计学处理统计学软件为 SPSS10.0，所有数据以 xs 表示，组间比较采用方差分析。2 结 果2.1 乏氧测定4荷瘤裸鼠注射 9
13、9mTc-HL91 后自 5min 起肿瘤部位放射性增高，显影开始清晰，对照组肿瘤于 3h 显影更为明显,与周围组织有较高的对比度（图 1） ；治疗后第 2d，3h 显影治疗组 T/NT 比值和肿瘤的放射性滞留时间低于对照组；而治疗后在第 14d 治疗组 T/NT 比值和肿瘤的放射性滞留时间高于对照组（P0.05）（表 1） 。2.2 瘤重和 MVD治疗后第 2d 治疗组和对照组的瘤重无明显区别，第 14d 治疗组肿瘤的生长受到抑制，瘤重明显低于对照组。CD34 标记血管内皮细胞，所有肿瘤组织均有阳性表达（图 2） ，内皮细胞被染成棕黄色，微血管有的形成管腔，有的仅为单个内皮细胞或内皮细胞簇，肿瘤边缘组织的 MVD 高于中央。治疗后第 2d 治疗组瘤组织中 MVD 少于对照组（42.892.63 vs. 52.783.09，P0.05)。治疗后第 14d 治疗组瘤组织中 MVD 明显少于对照组（27.892.51 vs. 66.112.83，P0.01）和第 2d 治疗组（27.892.51 vs. 42.892.63，P0.01） 。3 讨 论紫杉醇是一种细胞生长抑制剂，其药用溶媒聚氧乙基代蓖麻油进入体内后有可能引起危及生命的超敏反应，为减少该反应的发生，我们应用紫杉醇脂
