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1、中南药学 2014 年 1 月 第 12 卷 第 1 期 Central South Pharmacy. January 2014, Vol. 12 No. 1 47 植物内源激素检测方法新进展 文静 1，2，孔维军1，罗红梅1，王建2，杨美华1* （1. 中国医学科学院 2. College of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137) Abstract: Plant endogenous hormones, small molecular compounds produced
2、 by plants, play various roles in the physiology at very low concentrations and regulate all plant developmental processes. They have very low contents in plants with unstable properties, so accurate quantitative analysis of plant hormones becomes the diffi cult point and hotpot in research on plant
3、 hormones. With the progress of analytical techniques and the emergence of new instru- ments, the extraction and purifi cation technology as well as detection of plant endogenous hormones are constantly updated. At present, extraction by organic solvent and purifi cation by solid phase extraction co
4、lumn are most common in sample preparation. Detection methods include biological appraisal, physical and chemical analysis and immuno- assay, of which physical and chemical detection methods are most widely used. This paper summarizes the research progress in the extraction, purifi cation and detect
5、ion method of plant hormones to provide certain references for the further study of plant endogenous hormones. Key words: plant endogenous hormone; preparation technology; detection method; research progress 基金项目：中国医学科学院创新团队（医科人便函 201126 号）；教育部与创新团队发展计划（No.RT1150）。 作者简介：文静，女，硕士研究生，主要从事中药质量分析研究。 * 通讯
6、作者：杨美华，女，研究员，博士研究生导师，主要从事中 药质量与安全性分析研究，Tel：（010）57833277，E-mail： 植物内源激素是由植物自身代谢产生，自产生部位 移动到作用部位，在极低浓度下就有明显生理效应的一 类微量有机物质，也被称为植物天然激素或植物激素。 这些小分子植物内源激素在细胞分裂与伸长、组织与器 官分化、开花与结果、成熟与衰老、休眠与萌发以及离 体组织培养过程中，相互协调地调控植物的生长、发育 与分化 1。1928 年温特证实了生长素的存在，是首个被 证实存在的植物内源激素，随后 1934 年郭葛等 2 从植物 中分离出了生长素。此后，其他植物内源激素陆续被科 学家
7、们发现。传统植物内源激素主要分为五大类，即生 长素（IAA）、赤霉素（GA）、细胞分裂素（CTK）、 脱落酸（ABA）和乙烯（ET）3-4。随着分析技术的进步， 新的植物内源激素不断被发现，如多胺、水杨酸类、油 菜素内酯和茉莉酸等。尽管植物内源激素为简单的小分 子有机化合物，它们却有着非常复杂、多样的生理效应， 不仅可以通过调控作物生长发育等过程而直接影响作物 产量，也可以通过参与调控作物对各种不利条件 5 和生 物胁迫 4 的适应性而减少损失。例如，茉莉酸（JA）和 乙烯（ET）不仅可以协作调控植物的生长，并且能增强 植物对腐生性真菌的耐受性。有研究 6 通过反向遗传学 手段，首次证明了乙烯
8、信号通路中的重要转录因子 EIN3/ EIL1 是乙烯与茉莉素的信号交叉节点，并介导部分茉莉 素对植物根发育的调控作用。 植物内源激素作为植物次生代谢产物，在植物体内 Central South Pharmacy. January 2014, Vol. 12 No.1 中南药学 2014 年 1 月 第 12 卷 第 1 期 48 含量极低，一般鲜样中的含量为 0.1 50 ngg 1，仅 相当于其他类次生代谢产物（如黄酮类）的万分之一 7， 但对植物生长发育却有着重要作用，因此，采用高灵敏 度、高专一性的检测方法精确测定植物体内微量的植物 内源激素对进一步研究植物内源激素的生物合成、 运输、
9、 代谢以及分子调控机制有重要意义。 本文就近年来植物内源激素的提取、纯化技术及检 测方法作简要概述，并对植物内源激素今后的发展方向 进行展望，以期为植物内源激素的深入研究提供参考。 1 植物内源激素测定时样品前处理技术 由于植物内源激素在植物体内含量很低、性质不稳 定，样品的前处理是进行植物内源激素测定的前提和关 键步骤。首先，待测样品需用液氮冷冻，以保证最大限 度地保持植物的原始状态，不会因为植物受伤而导致植 物含量的失真，在低温条件下将样品研磨成粉末。然后， 选择合适的溶剂和纯化方法对目标激素进行提取、纯化 和富集。 1.1 提取 有机溶剂提取是最传统和有效的植物内源激素提取 方法，一般根
10、据“相似相溶”原则选择合适的提取溶剂， 在不改变植物激素成分变化条件下，最大限度地提取出 目标植物激素并尽量降低干扰杂质的溶出。 甲醇分子量小，渗透性较强，一直是植物内源激素 提取的首选溶剂。Lu QM 等 8 采用 80% 冷甲醇提取新鲜 植物中生长素，经液液萃取纯化后用 LC-MS 进行分析测 定，4 种生长素类激素的回收率都 80%。Durbanshi A 等 9 用 80% 甲醇提取了多种植物中的 ABA、IAA、JA， 经液液萃取纯化后经 LC-ESI-MS/MS 分析测定，回收率 依次为 ABA 96.5%，IAA 99.4%， JA 99.2%，均 符合要求。 除甲醇外，乙腈、丙
11、酮也是常用的提取溶剂。黄岛 平等 10 采用 70% 冷丙酮提取蜜梨花芽中 4 种植物内源 激素，液液萃取净化后用 UPLC-PDA 进行分析测定，4 种激素的回收率都 98%。为达到更高的提取要求，也 有研究者在提取溶剂中加少量酸。Pan XQ 等 11 用丙醇 - 水 -HCl（2 ：1 ：0.002，v/v/v）提取拟南芥中主要植物 内源激素及其相关代谢产物，经液相色谱串联质谱分析 测定，每种物质的检测限可达 0.01 10 pgg 1 鲜重。 张军等 12 采用乙腈 - 水 - 甲酸（4 ：1 ：0.005，v/v/v）溶 液提取葡萄中的赤霉素，经 Strata-X 固相萃取小柱净化
12、后用 HPLC-MS/MS 测定，回收率 90%。Kojima M 等 13 采用甲醇 - 水 - 甲酸（15 ：4 ：1，v/v/v）提取水稻中的 4 种植物内源激素，检测结果显示混合溶剂的提取效率较 高。部分植物内源激素如生长素化学性质不稳定，易受 到提取环境的影响，在分析过程中应避免光照、高氧和 高温等外部环境，可在提取溶剂中加入铜试剂等抗氧化 剂以避免植物激素的降解。 除了传统的有机溶剂提取法，也有研究者采用超声 波法提取植物内源激素，结果表明该方法也不失为一种 快速高效的植物内源激素提取方法。但由于植物内源激 素受热易分解，因此建议用该方法进行提取时最好将温 度控制在 4 左右 14
13、。 1.2 纯化 提取的植物内源激素粗提物中含有大量的色素和酚 类等干扰物质，影响检测结果的准确性。因此，检测前 需要对粗提物进行纯化。 常用的纯化方法有液相萃取法和固相萃取法等。液液 萃取法是有机溶剂在特定 pH 条件下，利用密度不同而分 层的特性来萃取所需的物质，该方法所需溶剂量大，对水 溶性较好的激素纯化效率不高，而且在提取过程中还会 产生难以克服的乳化现象，目前在植物内源激素的提取 中已较少采用。与液相萃取法相比，固相萃取法具有节 约溶剂、简单快速、重现性好、回收率高等优点，已在 植物内源激素的纯化方面得到越来越多的应用。常用的 固相萃取柱有 Sep-pak C18柱、Cep-pak
14、C18柱、OasisMCX 柱和 OasisHLB 柱等。童建华等 15 选用 Sep-pak C18柱 富集棉花根中多种植物激素，用 50% 甲醇将小柱内的植 物激素洗脱后真空冷冻离心浓缩至干，最后用 20% 乙腈 复溶，经 HPLC 分析发现，5 种植物激素的回收率均 90%。曹赵云等 16 选用混合阴离子交换反相固相萃取柱 净化后用 LC-MS/MS 进行分析测定，结果发现 IBA 和 IAA 的加标回收率都 75%。Izumi Y 等 17 比较了同时 用 OasisMCX 柱和 OasisHLB 柱以及单用 OasisHLB 柱对 从拟南芥和烟草样品中提取的植物激素的纯化效果，结 果
15、发现同时采用 2 个柱子进行纯化可大大提高内标物的 回收率。 近年来发展起来的新型植物内源激素纯化技术包括固 相微萃取技术（SPME）、分散固相萃取（DSPE）、分 散液相微萃取（DLLME）和免疫亲和色谱（IAC）等。 SPME 只需一支类似进样器的固相微萃取装置即可完成萃 取、浓缩、解吸、进样等全部前处理和进样工作。该方法 在植物内源激素的提取中也有所应用 1，18。DSPE 是将固 相萃取吸附剂颗粒分散在样品的萃取液中充分混匀，萃取 液中的杂质被吸附剂所吸附，从而达到纯化目的。该技术 比普通的固相萃取技术操作更简便、成本更低，在国内外 植物激素的分析和应用中均有报道 19-20。分散固相
16、萃取中 常用到交联聚乙烯吡咯烷酮（PVPP），PVPP 是一种性能 良好的吸附多酚类和色素类杂质的交联聚合物，能有效除 去提取液中的酚类和有机酸等杂质。目前很多研究者 21-23 采用在提取液中加入适量 PVPP，充分搅拌后高速离心的 方法来除去植物提取液中的杂质。DLLME 集采样、萃取 和浓缩于一体，避免了固相微萃取中可能存在的交叉污染 问题，是一种高效、环保的前处理新技术，在植物内源激 素分析中有广泛的应用前景。Gupta V 等 24 采用 DLLME 方法纯化了常见绿色海藻中 5 种内源植物激素，经 HPLC 分析测定，线性范围可达 0.2 100 mgmL 1。 此外，IAC 也被引入到植物内源激素的纯化中，但 是由于植物内源激素的分子量一般相对较小、需要与大 分子物质连接后才具备抗原特性，在此基础上所获取的 抗体才可识别目标激素，因此免疫亲和色谱在植物内源 激素纯化中
