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1、Chi l 原核表达基本试验步骤将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录
2、调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。原核表达一般程序如下：获得目的基因准备表达载体将目的基因插入表达载体中（测序验证）转化表达宿主菌诱导靶蛋白的表达表达蛋白的分析扩增、纯化、进一步检测，其中包括：一、试剂准备（1）LB培养基。（2）1M IPTG（异丙基硫代-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于10ml ddH2O中,0.22m滤膜抽滤，-20保存。CCY的IPTG是1M的，用时进行1000倍稀释。二、操作步骤（一）获得目的基因1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不
3、同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。（二）构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。我们用Soultion I连接。（三）获得含重组表达质粒的表达菌种1、 将连接产物转化大肠杆菌BL21，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，
4、双酶切初步鉴定。2、 测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。3、 以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。（四）诱导表达1、 挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB（含kana 50g/ml）中37过夜培养。2、 按1100比例稀释过夜菌，一般将2ml菌加入到含200mlLB培养基培养瓶中, 37震荡培养至OD6000.4-1.0（最好0.6，大约需3h-4h。我用3.5h，有0.66-0.69）。3、 取部分液体作为未诱导的对照组,余下的加入IPTG诱导剂作为实验组，终浓度为1mM,两组继续37震荡培养3hr。n
5、sp2诱导4小时，比较好，3小时表达量较低。4、离心4500g30min收获沉淀。5、加25ml 50 mM PBS（pH 7.4）洗1次6、转到50ml离心管 8000rpm 10min。7、加入1/10体积的50 mM PBS（不可溶细菌加8M尿素50 mM PBS）重悬细菌。超声破碎（300W 4 S/4S,99次）。超声后液体变清澈。超声时探头离管底一定距离，防止管破裂。8、12000g，10min，取上清作为待纯化的样品。9、混匀镍柱，根据培养物及表达水平装柱2ml（加膜防镍柱漏）,用三个柱床体积50 mM PBS（不可溶细菌加8M尿素50 mM PBS）平衡柱子10、在柱中加入样品
6、，找打开开关使液体流出（1滴/10S），样品反复上样3次样品可以上样前调整pH至8.011、用3个柱床体积的50mM 咪唑的洗涤液洗涤柱子，除去杂蛋白12、用3ml 含400mM 咪唑洗脱目的蛋白。13、镍柱用20%的乙醇适量，4保存。14、SDS-PAGE电泳检测蛋白纯化效果（上柱前样本，上柱后样本，杂蛋白，目的蛋白，未诱导蛋白）附相关试剂配制：50mM PBSNaH2PO4.2H2O 1.48gNa2HPO4.12H2O 14.5046gNaCL 29.3gH2O 至 1000ml8M 尿素PBS：尿素240.24g，加上述PBS 至500 ml50mM咪唑: 咪唑0.3404g, 50m
7、M PBS100ml60 mM咪唑: 咪唑0.4084, 50mM PBS100ml200mM咪唑：咪唑1.3616g，50mM PBS100ml300 mM咪唑：咪唑2.042g，50mM PBS100ml400mM咪唑: 咪唑2.7232g, 50mM PBS100ml用浓盐酸调pH至7.4三 、注意事项（1）选择表达载体时，要根据所表达蛋白的最终应用考虑。如为方便纯化，可选择融合表达；如为获得天然蛋白，可选择非融合表达。（2）融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时，对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。Rosetta 有两套质粒，做表达时，先将质粒转入DH5a,测序，酶切
8、正确后再转入Rosetta;Pet30a通过酶切可保留C端HIS，通过终止密码子可保留N端密码子。包涵体的形成： 主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。 1、表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。 2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。 3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电
9、点时容易形成包涵体。 4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。因此有人采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。 包涵体表达的有利因素： 1、可溶性蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，包涵体表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解。 2、降低了胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高。 3、包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分离，有利于分离纯化。 4、对机械搅拌和超声破碎不敏感，易于破壁，并与细胞膜碎片分离。分离： 1、离心：5000-20000g15min离心，可使大多数包涵体沉淀，与可溶性蛋白分
10、离。 2、过滤或萃取方法： 洗涤： 由于脂体及部分破碎的细胞膜及膜蛋白与包涵体粘连在一起，在溶解包涵体之前要先洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂如2M尿素在50mM TrispH7.0-8.5左右,1mMEDTA中洗涤。此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。 溶解： 常用的变性剂有尿素（8M）、盐酸胍（GdnHCl6-8M），通过离子间的相互作用，破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。其中尿素的增溶效果少差，异氰硫酸胍（GdnSCN）最强。 去垢剂：如强的阴离子去垢剂SDS，可以破坏蛋白内的疏水键，可以增溶几乎所有的蛋白。问题是由于SDS无法彻底的去除而不允许在制药过程中
11、使用。 极端pH：可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白。如有人在pH9.0溶解牛生长激素和牛凝乳蛋白酶包涵体。有些蛋白可以溶解在60mMHCl中。这些方法只适合于少部分蛋白的增溶。 变性剂的使用浓度和作用时间：一般在偏碱性性的环境中如pH8.0-9.0，尿素在碱性环境中不稳定，一般不要超过pH1.0。有些蛋白只能用盐酸胍如IL-4。增溶时一般室温过夜，但盐酸胍在37度1小时便可以使多数蛋白完全变性溶解。 还原剂： 由于蛋白间二硫键的存在，在增溶时一般使用还原剂。还原剂的使用浓度一般是50-100mM2-BME或DTT，也有文献使用5mM浓度。在较粗放的条件下，可以使用5ml/l的浓度。还原剂的使用
12、浓度与蛋白二硫键的数目无关，而有些没有二硫键的蛋白加不加还原剂无影响，如牛生长激素包涵体的增溶。对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶，有时还原剂的使用也是必要的，可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。 复性： 通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M左右时结束。对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M 时复性过程已经结束。 复性中常采用的方法有： 稀释复性：直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制。 透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，有人称易形成沉淀，且不适合大规模操作，无法应用到生产规模。 超滤复性：在生产中较多的使用，规模较大，易于对透析速度进行控制，缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性。
