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1、1幽门螺杆菌实验室检测与应用价值作者：胥维勇，杨红，杨群，范小莉，何娟 【关键词】 幽门螺杆菌；方法学；应用价值1983 年由澳大利亚医生 RWarren 和 BMarshall 从胃黏膜组织中成功分离培养出幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)以来,Hp 与慢性活动性胃炎和消化性溃疡以及在发病过程中的作用已得到证实。但 Hp 感染缺乏临床表现特征，Hp 感染诊断主要依靠实验室检测。Hp 检测技术日益完善和准确，方法从细菌形态学发展进入到 Hp 全基因序列测定分析阶段。Hp 感染检测方法可分为：取胃黏膜标本检测 Hp，包括细菌培养、快速尿素酶试验、组织涂片和切片染色；呼气试
2、验和尿氨排出试验检测 Hp；血清免疫学方法检测 Hp。根据检测是否需做胃镜检查分为：直接检测法，必须在胃镜下取材，包括细菌培养、涂片染色、快速尿素酶试验、活检标本切片染色和多聚酶链反应等；间接检测法，不需要胃镜下取材，包括 13 C、14 C 呼气试验、15 N 尿氨排出试验和血清免疫学检测等。Hp 感染实验室检测的常用方法有：1 微生物学方法1.1 细菌培养法 从胃黏膜活检标本中分离培养出 Hp，再用形态学和生物化学方法鉴定，是诊断 Hp 感染最可靠的方法。Hp 是微需氧菌，不能在大气下和绝对厌氧条件下生长，它需要的气体条件是 N2 85%、CO2 10%、O2 5%，还需要有一定的湿度和较
3、好的营养成分。Hp 生长缓慢，形成的菌落细小，必须添加抑制杂菌生长的抗生素，才能提高 Hp 的检出率。尽管 Hp 感染诊断的金标准是分离培养，但它需要一些特殊设备和试验条件，国内尚未广泛开展，至今只有少数实验室把它用于科研，而不作为常规检测而用于临床。1.2 涂片检测法 在胃镜检查时用细胞刷在胃黏膜表面刷取黏液成分或取活检标本直接涂片，经革兰(Grams)染色，在光学显微镜下观察，Hp 呈 Grams 阴性，弯曲状、弧状、S 形和 C 形，形态特征较明显。涂片检测 Hp 是一种简单实用的方法,涂片标本未经任何处理不受外界因素影响，菌体保持完整，形态与生活时相仿。为简便染色过程,Grams 染色
4、亦可简化为石碳酸复红单染法1 ，染色效果不比 Grams 染色逊色。还可采用相差显微镜直接观察涂片检测 Hp 和用吖啶橙染色，荧光显微镜观察检测 Hp。2 快速尿素酶试验Hp 产生尿素酶的能力强，尿素酶分解胃液中尿素生成 NH3 和 CO2，快速尿素酶试验用于胃镜检查中诊断有无 Hp 感染。试验试剂包括尿素、pH 指示剂(酚红)、缓冲液和防腐剂。在酸性条件下，当 pH 值6.8 时，酚红指示剂呈黄褐色，如果活检标本中有 Hp 存在，尿素酶分解尿素产生 NH3 使试剂 pH 值发生变化而升至8.4，这时酚红指示剂由黄褐色变为红或紫红色。目前常用的尿素酶试剂在与2胃镜活检标本接触后几分钟后便可显色
5、，快速尿素酶试验属于间接试验，标本大小、细菌多少、反应时间、温度和湿度均可影响尿素酶试验结果。尿素酶试验具有快速、简便的优点，特别适合基层医院推广使用。3 同位素示踪剂方法这类方法主要是采用让患者口服同位素标记的尿素，利用 Hp 产生尿素酶能分解尿素的原理，以观察胃中 Hp 分解尿素的能力，以此判断患者是否感染了 Hp及感染的程度，这类试验现有两类三种。Hp 具有较强的内源性尿素酶，能分解胃内及核素标记的尿素，产生 CO2 和 NH3,CO2 被吸收后经肺呼出，分析呼气中的13 CO2 或 14 CO2 即可诊断 Hp 的存在。根据呼气试验类似的原理，15 N 尿氨排出试验是一种尿素在胃内分解
6、后，15 N 经吸收通过肾脏由尿排出的试验，让受试者口服稳定性同位素 15 N 标记的尿素，然后测定尿液中排出的 15 NH3 来判断胃内 Hp 的感染情况。这类试验方法属于间接检测，通过多次采集样本后在仪器上进行测定分析。3.1 呼气试验 呼气试验的原理是基于 Hp 产生大量的尿素酶，给感染 Hp 的患者口服同位素标记尿素溶液，则尿素被分解后产生同位素标记 CO2 由肺呼出。可收集呼气样本，用气体同位素质谱仪或液体闪烁扫描仪检测同位素标记 CO2 的量来检测 Hp。根据标记物的不同，分为 13 C 和 14 C 呼气试验。3.1.1 13 C 标记的尿素 用稳定性同位素 13 C 标记的尿素
7、，让患者口服后，尿素在胃中与 Hp 产生的尿素酶接触后分解成 13 CO2，测定其在总呼出量中所占的浓度，以判断胃中是否感染了 Hp 和感染程度。这种方法的最大优点是：体内测定胃内感染 Hp 的总体情况，避免了活检标本 Hp 分布不均造成的假阴性的结果；13 C 是一种稳定性同位素，对机体无损伤；它除了定性以外，还可做定量测定。它的最大缺点是需用高精度气体比值同位素质谱仪来测定，这种设备是一般医院不具备的贵重仪器。3.1.2 14 C 标记的尿素 用 14 C 标记的尿素让患者口服，用闪烁扫描仪测定患者呼出的 14 CO2，这种仪器在有核医学科的医院一般都有，测定方法比较方便。尽管它的优点类似
8、于 13 CO2 呼气试验，但是 14C 是一种放射性同位素，因此这项试验对孕妇和小孩不宜使用。3.2 尿氨排出试验 15 N 尿氨排出试验是根据类似呼气试验原理创立的，其方法是用 15 N 标记尿素让患者口服，然后收集 2 h 尿液检出其 15 N 尿氨的排出率，以判断胃内 Hp 感染程度。这一试验具有 13 CO2 呼气试验同样的优点，不需作胃镜，无放射性损伤，采集样本比呼气试验方便，测定准确性较高，缺点与 13 C 呼气试验相同，检测需用气体同位素质谱仪。由于 15 N 尿氨排出试验是一种尿素在胃内分解后，15 N 经吸收通过肾脏由尿排出的试验，因此有严重肝肾功能损害者不宜使用。4 血清
9、学方法通过血清中 Hp 抗体测定 Hp 感染的方法比较多，有酶联免疫吸附试验(ELISA)、乳胶凝集试验、免疫印迹试验和细菌凝集试验等，尤其以 ELISA 试验应用最广泛。3Hp 感染后会激发机体产生特异性体液免疫，血清中出现 IgG、IgA、IgM 抗体，常采用 ELISA 试验检测 Hp IgG 抗体。ELISA 试验是目前常用的方法，同时测定两种免疫球蛋白能提高这一方法的敏感性。在进行 ELISA 试验时，最重要的是抗原选择，该试验的敏感性虽高，但缺乏特异性，从而影响对试验结果的判断。要提高 ELISA 试验的特异性和敏感性，则需要对抗原进一步纯化，抗原则可获得较高的特异性和敏感性。血清
10、学方法简便，成本较低，患者对采血进行检测的方法比做胃镜检查更乐意接受。由于抗 Hp 抗体可长时间维持在阳性水平，至少需要6 个月12 个月才能降到足以预测治疗成功的程度，血清学方法便失去了原有的吸引力，但在流行病学调查中仍有它的应用空间。5 多聚酶链反应多聚酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR)实际上是一种核酸片段体外扩增试验。做试验的先决条件是首先必须清楚某一基因的核苷酸序列，然后人工合成其中两个特异性片段作为引物，在 PCR 仪上经过 30 个50 个循环扩增其核酸片段，使其成倍增长，然后取其片段作琼脂糖凝胶电泳，电泳后取出凝胶在紫外线灯下观察结果，即可判断
11、所得产物是否为基因产物。目前亦可用这一反应来检测标本中有无 Hp 的存在，甚至还可进一步用核苷酸序列分析或特异性探针加以鉴定。可是 PCR 高敏感性也有它致命的弱点，使用试剂浓度、操作温度、过度扩增、极少 DNA 污染等都可导致假阳性。严格控制，合理选择 DNA 扩增循环次数，防止污染，设置对照等都是不可忽视的因素。采用 PCR 技术在 Hp 诊断和评价治疗后根治效果有意义，但对实验室和试验条件要求高，如果在非标准条件下进行检测，有可能会出现悬殊的结果，特别是假阳性的大量出现。目前 PCR 技术不适合用于临床检测 Hp 感染。6 组织切片染色法6.1 胃黏膜活检标本 病理组织切片染色检测 Hp
12、 是最常用的方法，活检标本经石蜡包埋切片染色后，Hp 在显微镜下形态特征是菌体 2 m4 m 长，0.5 m 宽，Hp 为弧形成螺旋状弯曲样细菌，定植于胃黏膜上皮细胞表面、胃小凹和胃内腺腔中，常规 HE 染色凭 Hp 形态及定植部位可以识别。当 Hp 量少或有上皮细胞脱落时而难以辨认时，就需要采用其他组织化学染色方法来鉴别诊断，迄今没有一种染色方法对 Hp 的显示是特异的。显示 Hp 的染色方法有：改良Warthin-Starry 银染色、改良 Giemsa、碱性品红、石碳酸复红、亚甲蓝、中性红、甲苯胺蓝、甲基紫、甲苯酚紫和吖啶橙染色等 10 余种染色法。改良Warthin-Starry 银染
13、色是经典的 Hp 染色方法2 ，Hp 在黄色背景下呈现出黑色螺旋状形态，该染色方法技术要求高，操作繁琐，每次染色需加温、恒温及配显影液，热水冲洗等，若操作不当容易造成在切片上留下银颗粒沉淀与 Hp 横截面形态相混淆的现象；改良 Giemsa 染色是一步双色快速染色法，操作更为简便，染色效果好，现已广泛应用于常规检测和科研中3 ，在显微镜下 Hp 染成淡蓝色，菌体形态清楚，切片背景清晰，不但可观察到 Hp 数量、侵入深度和分布情况，还能观察到胃黏膜病理改变情况等；碱性品红、石碳酸复红、亚甲蓝、中性红、甲苯胺蓝、甲基紫、甲苯酚紫染色都是单染法，操作简便，染色时间短，菌体形态和切片背景呈一色性，当细
14、菌量少时应与黏液成分认真区分；吖啶橙荧光4染色，Hp 呈淡橙红色荧光，可以更好地辨别 Hp 的形态特征，尤其在 Hp 量少时优于 Warthin-Starry 和 Giemsa 染色，吖啶橙荧光染色简便、快速，但需要荧光显微镜进行观察；荧光抗体免疫组织化学方法也有人使用，不比组织化学染色方法有更多的优点。6.2 Hp 形态分布情况 通过组织化学染色显微镜下观察，Hp 呈单个散在或成团聚集，形态以螺旋状、弯曲杆状、球状菌最常见，Hp 在生存环境不利时易发生形态变异，球形变常见，短杆状、长丝体、巨球体等形态亦可见到。根据 Hp数量和分布密度进行半定量测定，将 Hp 感染分为 4 级：(-)：无特征
15、性细菌；(+)：仔细寻找有细菌发现，数量较少，稀疏散在；(+)：有大量散在分布或成丛的细菌,数量较多，比较密集；(+)：有大量的细菌，数量很多，聚集成团。Hp 感染检测方法应本着经济、快速、准确、简便、敏感、特异等原则，尽可能选择最佳方法，以便实施和推广。通过胃镜检查所取标本进行快速尿素酶试验和病理组织切片 Giemsa 染色检测 Hp，是目前各级医院诊断 Hp 感染最常用的检测方法。【参考文献】1 胥维勇,杨红,李科,等.应用涂片染色检测幽门螺杆菌J.诊断病理学杂志,2000，7(3):225.2 凌启波.实用病理特殊染色与组化技术M.广东高等教育出版社,1989:4245.3 杨红,胥维勇,李科,等.改良 Giemsa 染色在幽门螺杆菌检测的应用J.中国组织化学与细胞化学杂志,1996，5(1):101.
