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1、1川芎嗪洗脱支架预防支架内再狭窄的实验研究【摘要】 目的：研究川芎嗪洗脱支架(TES)抑制内膜增生防治再狭窄的效果及其机制。方法:小型猪 9 只随机分为 3 组,实验组植入 TES(TES 组),对照组植入金属裸支架(BMS 组)或雷帕霉素洗脱支架(SES 组)。术后第 28 天处死动物，组织病理学检测内膜厚度，免疫组织化学法测定增殖细胞核抗原(PCNA)，TUNEL 法测细胞凋亡，扫描电镜观察内皮细胞的覆盖情况。结果:术后第 28 天病理学证实，TES 组较 BMS 组管腔面积增加、支架内新生内膜面积和面积再狭窄百分比减小（P0.05） 。BMS 组较 TES 组 PCNA 细胞阳性率明显增
2、加（P0.05） ，TES组较 SES 组 PCNA 阳性率增加（P0.05） 。TES 组较 BMS 组单位面积内平滑肌细胞 (VSMC)凋亡数明显增加（P98%）制成，含雷帕霉素 130 g。另一对照组(BMS 组)采用相同结构 BMS。实验组和对照组支架均为不锈钢 316 L 金属管形网状支架，两组支架大小为2.53.0 mm /16 mm。1.3 冠脉内支架植入猪术前予氯胺酮 12 mgkg-1 肌肉注射基础麻醉，3戊巴比妥钠 20 mgkg-1 术前和术中间断静脉注射强化麻醉。备皮及皮肤消毒后穿刺股动脉,插入 6 F 动脉鞘注入肝素 150200 Ukg-1，常规行冠脉造影，为避免局
3、部药物释放干扰,常规对同一头猪左前降支及左回旋支冠状动脉中段各植入相同类型的支架，支架球囊与血管直径比值为(1.11.2)1， 1015 atm（1 atm=101.325 kPa）扩张 30 s,形成冠状动脉狭窄模型2 。术后每日喂阿司匹林 100 mg、氯吡格雷 75 mg，并予以普通饮食喂养。1.4 病理学观察术后第 28 天行冠状动脉造影后处死动物，剥离冠状动脉，固定 24 h 后切片、染色。对内膜、中膜和外膜进行组织学分析，运用计算机图像分析系统测定血管狭窄程度。用免疫组织化学法测定增殖细胞核抗原(PCNA),TUNEL 法测 VSMC凋亡,扫描电镜下观察内皮细胞的覆盖情况。1.5
4、统计学处理3 组数值均采用 x-s 表示,两组间用独立样本 t 检验,使用 SPSS 12.0 统计软件进行分析,P0.05 为差异有显著意义。2 结 果2.1 小型猪支架植入情况9 只猪均成功在左前降支及左回旋支冠状动脉中段植入支架, 支架植入术后即刻冠状动脉造影证实管腔通畅,无充盈缺损、管壁夹层、栓塞、支架移位或远端冠状动脉痉挛,无急性血栓形成。所有动物均顺利完成术后第 28 天的复查。2.2 支架植入 28 d 后的冠状动脉内膜增殖情况见表 1。TES 组与 BMS 组相比, 支架内面积无显著差异,但管腔面积、新生内膜面积和平均面积狭窄百分比有显著性差异（P0.05） 。TES 组与 S
5、ES 组相比支架内面积、 管腔面积、新生内膜面积和平均面积狭窄百分比均无显著差异。见图1。表 1 支架植入 28 d 后冠状动脉内膜增生情况的比较32.3 PCNA 阳性率及 VSMC 凋亡结果见表 2。TES 组内膜 PCNA 阳性率较 BMS 组明显降低（P0.01）,TES 组较 SES 组PCNA 阳性率增加（P0.05） 。TES 组较 BMS 组单位面积内 VSMC 凋亡数明显增加（P0.01） ，TES 组与 SES 组单位面积内 VSMC 凋亡数差异无显著意义。2.4 扫描电镜结果见图 2。 表 2 支架植入 28 d 后 PCNA 阳性率和单位面积 VSMC 凋亡数的比较 T
6、ES 和 BMS 组 28 d 血管内皮细胞完全覆盖，SES 组基本覆盖，但内膜不平整。3 讨 论川芎嗪是从中药伞形科植物川芎(Ligusticum Chuanxiong) 的根茎中提取的有效成分,化学结构为四甲基吡嗪。已有临床试验证实,口服川芎嗪具有防治PCI 术后再狭窄作用3 。动物实验显示，TES 与 BMS 相比，新生内膜面积明显减少,管腔面积明显增大，TES 能抑制内膜增殖,无致栓性,具有良好的生物相容性4 。本实验证实,与 BMS 相比，TES 可显著抑制支架植入术后血管内膜增生和减少再狭窄的发生。TES 预防支架内再狭窄的作用机理为:(1)抑制 VSMC 增殖、迁移。 内皮损伤后
7、 VSMC 增殖并呈激活状态,细胞凋亡减少，PCNA、型胶原、型胶原、血小板衍生生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、Bcl-2 和c-myc 的表达增高,Bax 表达降低5 。而川芎嗪通过抑制 VSMC 型胶原、型胶原、FGF、PDGF 和 c-myc 表达,达到抑制 VSMC 增殖的作用6 。同时川芎嗪能通过降低细胞内钙调蛋白（CaM） 、钙调神经磷酸酶（CaN）活性下调细胞内 c-mya、PCNA 表达水平，从而显著抑制血管紧张素（Ang）诱导的 VSMCs 增殖7 。并且通过下调 PDGF-BB 刺激的骨桥蛋白 mRNA 的表达,削弱了 VSMC 的迁移能力8 。本实验亦
8、证实，内膜 PCNA 阳性率 TES 组较 BMS 组明显降低,提示 TES可以抑制新生内膜 VSMC 的增殖,但较 SES 抑制新生内膜 VSMC 的增殖作用要弱。(2)促进 VSMC 调亡。川芎嗪通过抑制 bcl-2 的表达、促进 Bax 的表达, 从而促进 VSMC 的凋亡, TUNEL 染色阳性细胞数增多6 。本实验证实,TES 组较 BMS 组单位面积内 VSMC 凋亡数明显增加，提示 TES 能够诱导 VSMC 调亡。由此可见，抑制 VSMC 增殖、迁移并促进 VSMC 凋亡可能是 TES 预防支架内再狭窄的主要机制。第 1 代 DES 导致支架内血栓的确切机制并未明确，目前考虑与
9、手术操作本身、病人和病变的特性、支架的设计、过早的停用抗血小板药物等几个因素有关。虽然 DES 的最初目的是防止 VSMC 的增殖和迁移，但同时也导致了内皮化延迟或内皮功能异常，诱导了凝血激酶的表达，最终形成了前凝血激酶的环境9 。TES 相对于第 1 代 DES 具有其独特的优势：(1)血管内皮细胞的保护作用。川芎嗪作用于正常人胎儿脐静脉内皮细胞（HUVEC）后,通过上调一氧化氮合酶(NOS)、弹力蛋白、5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶、谷光甘肽 s-转移酶基因的表达，下调脂蛋白(a)、热休克蛋白 60、细胞趋化因子和细胞色素 P450 系列等基因的表达,4从而在基因水平通过多环节调节内皮功能
10、10 。并且通过增加前列环素(PGI2)释放, 减少内皮素（ET）基础释放量而对 HUVECs 具有促进增殖作用，并部分拮抗 H2O2 损伤 HUVECs 所致 LDH、ET 释放增加，PGI2 释放减少和细胞内脂质过氧化产物丙二醛生成增加的作用。其机理可能与其抗脂质过氧化作用有关11 。动物实验证实,川芎嗪可有效抑制结扎 LAD 后缺血再灌注对冠脉内皮细胞及心肌的损伤,减轻冠状动脉狭窄和心肌梗死的程度12 。(2)抗血小板聚集和血栓形成。低浓度的川芎嗪通过抑制磷酸肌醇和 TXA2 的合成而发挥抗血小板作用;较高浓度的川芎嗪则通过结合血小板糖蛋白b/a 复合物而抑制血小板的聚集13 ，并且通过
11、增强 NOS 活性、刺激血小板中 NO 的生成14以及发挥钙拮抗剂作用而使血小板内钙离子浓度降低,阻断钙离子对血小板激活和前列腺素的代谢15 。以上实验结果均提示，川芎嗪在保护血管内皮,保持血管壁的平滑、完整,预防血栓的形成等方面具有重要价值。本实验进一步证实,BMS 组 28 d 扫描电镜观察显示支架表面有完整的内膜组织覆盖，TES 组 28 d 扫描电镜观察显示有完整的内膜组织覆盖，但有较多的白细胞浸润，考虑为多聚物引起的局部炎症反应。SES 表面血管内皮基本覆盖，但有较多纤维素、白细胞等积聚。提示TES 不影响血管内皮的愈合，而 SES 组血管内皮基本覆盖，但纤维素等的积聚可能增加支架内
12、血栓形成的风险。由本实验可知,TES 通过抑制 VSMC 增殖、迁移并促进 VSMC 凋亡的作用，降低了支架植入术后再狭窄的发生。同时由于其特有的血管内皮细胞的保护作用和抗血小板聚集和血栓形成的作用，不影响血管内皮的愈合，有降低支架内血栓形成风险的作用，是一种防治再狭窄的新策略。【参考文献】1PFISTERER M, BRUNNER-LA H P, BUSER P T, et al.Late clinical events after clopidogrel discontinuation may limit the benefit of drug-eluting stents:an obse
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