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1、 产品信息和操作指南产品信息和操作指南 Mouse IL-2 预包被预包被 ELISA kit Cat# : DKW12-2020-048 / DKW12-2020-096 本试剂盒专用于科研，而非用于诊断本试剂盒专用于科研，而非用于诊断 Mouse IL-2 DKW12-2020 目目 录录 产品简介产品简介 1 知识背景知识背景 1 试剂盒提供的试剂试剂盒提供的试剂 2 需要实验者自行准备的试剂与仪器需要实验者自行准备的试剂与仪器 2 注意事项注意事项 3 试剂的配制试剂的配制 5 操作过程操作过程 7 结果分析结果分析 9 试剂盒的保存试剂盒的保存 9 操作步骤一览表操作步骤一览表 10
2、 参考文献参考文献 11 ELISA 测定中可能会出现的问题及解决方法测定中可能会出现的问题及解决方法12 预包被预包被 ELISA 试剂盒系列产品试剂盒系列产品 15 - 1 - 1、 产品简介：产品简介： 达优小鼠 IL-2 ELISA 试剂盒是通过酶联免疫吸附技术， 定量 检测细胞培养上清液和小鼠血清、血浆和其他体液中天然和重组 IL-2 的浓度。本试剂盒为预包被板，“夹心一步”完成，整个过程 孵育时间不超过 2.5 小时，洗涤 8 次，操作时间大大减少。本试剂 盒专用于科研，而非用于诊断。 使用前请仔细阅读说明书并检查试剂盒组分，若有任何疑问 请与达科为生物工程有限公司联系，E-mai
3、l：RD. 检测范围：500-7.8 pg/mL 灵敏度：3 pg/mL 重复性：板内、板间变异系数均10。 2、 知识背景：知识背景： 白细胞介素-2（Interleukin-2，IL-2）主要由有丝分裂原或抗原 活化的 T 淋巴细胞分泌，是一种多效细胞因子（1，2） 。它在抗原 特异的 T 细胞的克隆扩增中起着关键的作用。研究表明，它介导 了多种细胞类型的多种免疫反应。 - 2 - 3、 试剂盒提供的试剂：试剂盒提供的试剂： 试剂试剂 规格规格 配制配制 Cytokine standard 2/1 瓶* 干粉状，按瓶上说明操作 Biotinylated antibody 2/1 瓶* 1：
4、100 用 Dilution buffer R（1） 稀释 Streptavidin-HRP 2/1 瓶* 1：100 用 Dilution buffer R（1） 稀释 Dilution buffer R（1） 3/2 瓶* 即用型 Washing buffer（50） 1 瓶 150 用蒸馏水稀释 TMB 1 瓶 即用型 Stop solution 1 瓶 即用型 Precoated ELISA plate 812 或 86* 即用型 封板膜 2/1 张* 即用型 说明书 1 份 *：96/48 Tests 4、 需要实验者自行准备的试剂与仪器：需要实验者自行准备的试剂与仪器： 1 酶标仪
5、（建议参考仪器使用说明提前预热） 2 微量加液器及吸头：P10，P50，P100，P200，P1000 3 蒸馏水或去离子水 4 全新滤纸 5 旋涡振荡器和磁力搅拌器 6 37温箱 - 3 - 5、 注意事项：注意事项： 1. 试剂应按瓶上标签说明储存，使用前室温平衡室温平衡20-30 分钟。 实验前室温平衡对 Washing buffer（50） 、Dilution buffer R （1） 、Precoated ELISA plate 和 TMB 有重要意义。 2. 冻干标准品冰上操作，按照标签说明溶解干粉，充分混匀充分混匀， 按照一次使用量分装，-20贮存，避免反复冻融。 3. 预包被板
6、条使用前， 请恢复到室温后再打开外包装袋， 实验 中不用的板条立即放回包装中，密闭封口密闭封口，4可保存 1 个 月。其余不用试剂应包装好或盖好。 4. Washing buffer（50）在 4保存可能有结晶析出结晶析出，使用前 务必使结晶完全溶解后（如加热、平衡温度后混匀等）再 配置成 Washing buffer（1）工作液。 5. HRP 和检测抗体体积量很小，使用前请高速短暂离心高速短暂离心管子， 以使管壁或瓶盖的液体沉积到管底。 6. 实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉污染。 7. 使用前检查试剂盒内各种试剂； 试剂稀释、 加样和中止反应 充分混匀或者摇匀对实验结果尤为重要，最
7、好使用低速频 率振荡器或者反应过程中每 15 分钟手工摇匀一次。 8. 实验板孔加入试剂的顺序应一致， 以保证所有反应孔的孵育 时间一致。 9. 使用洁净的塑料容器盛装洗涤液。 - 4 - 10. 洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸滤纸上充分拍干， 滤 纸上看不到水印。勿将滤纸直接放入反应孔中吸水。 11. TMB 对光敏感，避免长时间暴露于光下，避免金属接触影 响结果。有毒，避免用手接触！有毒，避免用手接触！准备使用的 TMB 若变为蓝 色，表明 TMB 已经污染，请丢弃。请在终止反应后 10 分 钟内读取 OD 值。 12. 请严格按照说明书标明的时间和温度进行孵育。 冬季室内温 度偏
8、低，请使用恒温箱或培养箱孵育恒温箱或培养箱孵育为好。 13. 试剂盒在保质期内使用，且不同批号试剂不要混用。 14. 500 pg/mL 以上的结果为非线性的，根据此标准曲线无法得 到精确的结果。大于 500 pg/mL IL-2 的样品应以 Dilution buffer R(1)稀释后重做。在结果分析时，结合考虑相应的 稀释度。 15. 特异性：不与小鼠其它细胞因子反应。 - 5 - 6、试剂的配制：、试剂的配制： 1. 提前 20 分钟将 Washing buffer(50)和即用溶液即用溶液从试剂盒中 取出，以平衡至室温。 2. Cytokine standard：Standard 为
9、冻干粉。先按标签说明将冻 干粉溶解，静置 5-10 分钟，再用 Dilution buffer R（1）稀 释到推荐检测浓度。标准品溶解后混匀，准确倍比稀释，严 格操作非常重要。 标准品的倍比稀释最好在进口的或者硅化 的 EP 管中完成，减少非特异性吸附。在实验孔内进行倍比 稀释时，注意操作规范，枪头勿刮划预包被的孔底。母液若 没有用完请按照一次用量分装，-20保存。 * 推荐标准品浓度梯度为： 500 pg/mL、 250 pg/mL、 125 pg/mL、 62.5 pg/mL、31.3 pg/mL、15.6 pg/mL、7.8 pg/mL。 3. Biotinylated antibod
10、y：1100用 Dilution buffer R(1)稀 释，混匀制成 1antibody 工作液。工作液。 4. Streptavidin-HRP ：1100用 Dilution buffer R(1)稀释， 混匀制成 1HRP 工作液。工作液。 - 6 - 5. Washing buffer(50)：150 用蒸馏水稀释。 6. 即用型溶液即用型溶液 ? Dilution buffer R(1): 用于稀释 Biotinylated antibody、 Streptavidin-HRP 和和 Cytokine standard。 ? TMB ? Stop solution - 7 - 7
11、、操作过程：、操作过程： 1. 使用前，将所有试剂充分混匀，避免产生泡沫。 2. 根据实验孔（空白和标准品）数量，确定所需的板条数目。 样品（含标准品）和空白都应做复孔。 3. 加样加样：100 L/well 加入稀释后的 Cytokine standard 至标准品 孔，100 L/well 加入样品至样品孔，设置空白孔，用 Dilution buffer R (1)代替样本和标准品。 4. 加检测抗体加检测抗体：50 L/well 加入稀释后的 Biotinylated antibody。 混匀后，盖上封板膜，37温育 90 分钟。 5. 洗板洗板：扣去孔内液体，300 L/well 加入
12、 1washing buffer；停 留 1 分钟后弃去孔内液体。重复 4 次，每一次在滤纸上扣干。 6. 加酶加酶：100 L/well 加入稀释后的 Streptavidin-HRP。盖上封板 膜，37温育 30 分钟。 7. 洗板洗板：重复步骤 5。 8. 显色显色：100 L/well 加入 TMB，37避光温育 5-30 分钟之间， 根据孔内颜色的深浅（深蓝色）来判定终止反应。通常显色 10-20 分钟可以达到很好的效果。 9. 终止反应终止反应： 100 L/well 迅速加入 Stop solution 终止反应。 - 8 - 10.读板读板： 终止后10分钟内， 用检测波长 （
13、measurement wavelength） 450 nm 读值。推荐用双波长即检测波长（measurement wavelength）450 nm、参考波长或校正波长（reference wavelength）610-630 nm 同时读板，测量结果会更准确。 - 9 - 8、结果分析：、结果分析： 1. 有两种设定空白对照的方案： 1) 将 TMB 空白显色孔设为对照。所有的标准品和样品的 吸光值减去空白孔的吸光值后， 在坐标纸上画出曲线， 以吸 光值作为纵坐标，以浓度作为横坐标。 2) 将零孔设为对照。得到的数据可以直接在坐标纸上画出 曲线。 2. 根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓
14、度。 用户也可以使 用各种应用软件来计算。若样品 OD 值高于标准曲线上限，应 适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。 0.0 0.6 1.2 1.8 2.4 3.0 0200400600 Mouse IL-2 Concentration （pg/mL） Absorption 450 nm 9、试剂盒的保存：、试剂盒的保存： 4C 可稳定保存可稳定保存 12 个月。个月。 注意：注意：本图仅供参考，应以同次试验标准品所 绘标准曲线来计算标本含量。 - 10 - 10、操作步骤一览表：、操作步骤一览表： 加样品样品或配好的标准品标准品，设置对照，100 L/well 加生物素标记的抗体生物素标记的抗体，50 L/well，混匀 加亲和素亲和素-HRP 标记物，100 L/well 加 TMB 显色液，100 L/well 加 Stop solution 100 L/well，终止反应 在 450 nm 处读取吸光值 37 温育 90 分钟； 洗 4 次 37 显色 5-30 分钟 10 分钟内读板 37 温育 30 分钟； 洗 4 次 无需温育，直接进行下 一步操作 - 11 - 11
