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1、1瘦素受体在实验性多囊卵巢综合征大鼠卵巢中的表达及其意义【摘要】 目的 研究来曲唑诱导建立多囊卵巢综合征（PCOS）动物模型中卵巢组织瘦素受体（ObR ）及其 mRNA 的表达，探讨卵巢 ObR 变化与 PCOS 发病机制的关系。 方法 6 周龄清洁级雌性 SD 大鼠 45 只，分为正常组、溶剂组和来曲唑组，各 15 只。正常组每日自由摄取食物和水；溶剂组每日给予 1羟甲基纤维素水溶液 2 mL/kg 灌胃；来曲唑组以来曲唑 0.5 mg/kg 灌胃。观察大鼠体质量、动情周期、卵巢质量及其形态学改变，测定血清黄体生成素（LH） 、睾酮（T） 、胰岛素（INS） 、瘦素（LEP）及血糖（FG）水
2、平，采用免疫组织化学和Real Time RTPCR 方法检测大鼠卵巢中 ObR 及其 mRNA 的相对表达，并对 3组的各指标进行比较。 结果 来曲唑组大鼠体质量和卵巢质量指数升高，动情周期消失，卵巢体积增大，白膜增厚，HE 染色可见较多囊状扩张的卵泡且黄体数量明显下降，血清 T、LH、INS、LEP 水平明显升高（P0.05） ；卵巢 ObR及其 mRNA 表达明显增强（P0.05） 。 结论 来曲唑诱导建立的 PCOS 动物模型临床表现与人类似；卵巢中 ObR 表达上调，可能是导致 PCOS 患者不排卵、生育力下降的原因之一。 【关键词】 多囊卵巢综合征； 卵巢； 瘦素； 受体，肽； 疾
3、病模型，动物多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是生育年龄妇女常见的内分泌紊乱性疾病，以卵巢的功能紊乱为特征，常表现为不孕和肥胖，但其发病原因目前尚无定论。瘦素（leptin，LEP）是肥胖基因（ob 基因）的表达产物，近年来的研究认为, LEP 是营养与生殖之间的代谢信号，它在生殖方面有许多重要的调节作用12 。研究还显示，LEP 存在于卵泡液中,且 LEP 受体（ObR ）在人卵巢中几种不同的细胞上也有表达，表明 LEP 能够对性腺行使直接的作用3。笔者通过研究 PCOS 大鼠卵巢中 ObR 及其 mRNA 的表达情况，探讨其与 PCOS 发病机制
4、的关系，现报告如下。1 材料和方法1.1 PCOS 动物模型 6 周龄清洁级雌性 SD 大鼠，购自中国科学院上海实验动物中心许可证号：SCXX(沪)20070005 ，平均体质量 180 g，二级动物房饲养，恒温 22 ，光照 12 h、黑暗 12 h 交替，自由摄取食物和水。每日定时作阴道涂片检查，选择动情周期 45 d，连续 2 个正常动情周期的大鼠即开始用于实验，共选出 45 只，分为正常组、溶剂组和来曲唑组，各 15 只。来曲唑组每日给予溶解在 1羟甲基纤维素水溶液（CMC）2 mL/kg 的来曲唑（芙瑞，江苏恒瑞医药股份有限公司）0.5 mg/kg 灌胃，连续 21 d45 ；正常组
5、每日自由摄取食物和水；溶剂组每日给予 CMC 2 mL/kg 灌胃。1.2 大鼠体质量及动情周期 每日同一时间称量大鼠体质量，同时进行阴道2脱落细胞涂片，瑞氏染色后显微镜下观察细胞形态的变化，确定大鼠动情周期的情况。1.3 大鼠血清中各项指标 末次给来曲唑 24 h 后，禁食 8 h，对所有大鼠进行下腔静脉取血，采用放射免疫分析法测定大鼠血清黄体生成素（LH） 、睾酮（T）及胰岛素（INS） 、LEP，试剂盒购自天津市协和医药科技有限公司，批内和批间变异系数分别10%和50%细胞着棕黄色为强阳性，评 3 分；50%着黄色为阳性，评2 分；0.05） ；模型建立 21 d 后，来曲唑组的大鼠体质
6、量和卵巢质量指数均明显升高,与正常组及溶剂组比较，差别均有统计学意义（P0.05，表 1） 。表 1 模型建立后大鼠体质量和卵巢质量指数的比较 卵巢质量指数=卵巢质量/大鼠体质量100. 与正常组比较，：P0.05.2.2 大鼠动情周期 正常组和溶剂组阴道脱落细胞变化符合正常大鼠动情周期，来曲唑组在给药第 5 天起，陆续出现动情周期消失，且均处动情间期时相，即仅见大量白细胞，偶见少量角化细胞，提示无排卵。2.3 卵巢组织学变化 肉眼观察：正常组和溶剂组表现为卵巢色泽红，未见囊状扩张卵泡；来曲唑组为卵巢表面苍白，白膜增厚，体积增大，可见较多囊状扩张的卵泡。组织切片 HE 染色，正常组和溶剂组示多
7、个黄体及不同发育阶段的卵泡，卵泡内颗粒细胞呈多层，多为 89 层，卵巢白膜较薄（图 1A，1B） ；来曲唑组示有早期发育的较多的小卵泡及闭锁卵泡，囊状扩张卵泡明显增加，颗粒细胞层数减少至 23 层，卵泡内卵母细胞或放射冠消失，黄体数量明显下降并伴有不完全的黄素化，卵巢白膜较厚（图 1C） 。2.4 血清中各项指标测定 来曲唑组大鼠血清中4INS、T、LH、LEP、HOMAIR 明显高于正常组和溶剂组（P0.05） ，见表 2。表 2 各组血清中各项指标的测定结果 FG：血糖；INS：胰岛素；T：睾酮；LH：黄体生成素；LEP：瘦素；HOMAIR：胰岛素敏感指数. 与正常组比较，：P0.05.
8、A：正常组（100）：多个黄体及不同发育阶段的卵泡，卵泡内颗粒细胞呈多层，卵巢白膜较薄；B：溶剂组（400）：卵泡内颗粒细胞呈多层，多为 89 层；C：来曲唑组（100）：有早期发育的较多的小卵泡及闭锁卵泡，囊状扩张卵泡明显增加，颗粒细胞层数减少至 23 层，卵泡内放射冠消失，黄体数量明显下降并伴有不完全的黄素化，卵巢白膜增厚.2.5 卵巢中 ObR 的表达情况 根据染色强度与阳性细胞百分数半定量评分,来曲唑组大鼠卵巢 ObR 相对表达量2.5（23）明显高于正常组1（12）和溶剂组1（11.75），差别具有统计学意义（P0.05） 。A：正常组；B：溶剂组；C：来曲唑组. ObR 阳性染色者
9、在细胞质和/或细胞膜中可见棕黄色和/或黄色着色颗粒, 阳性细胞分布不均匀, 多呈散在片状或灶状分布，细胞核未见阳性细胞染色，来曲唑组其阳性表达明显强于正常组和溶剂组.2.6 卵巢中 ObR mRNA 表达结果 PCR 产物电泳进行产物鉴定，扩增片段大小和设计的内参基因（170 bp）和目的基因（125 bp）扩增长度一致（图 3） 。实时荧光相对定量分析结果如表 3 所示，卵巢中 ObR mRNA 在来曲唑组的表达均显著高于正常组和溶剂组（P0.01） 。3 讨 论PCOS 主要表现为稀发排卵或者不排卵，生育力低下，是引起女性不排卵性不孕的主要原因。LEP 是由肥胖基因编码的 16 kD 的糖
10、基化蛋白，除参与调节机体能量代谢和脂肪聚集外，还参与神经、内分泌和生殖系统的调节。ObR 在中枢和外周组织均有选择性表达，包括下丘脑、脂肪组织、卵巢、睾丸等组织，LEP 通过结合靶组织上的 ObR 激 ObR:瘦素受体. 1：marker；2：actin；3：ObR.5活胞内信号传导因子及转录家族蛋白后发挥作用。国外报道在卵巢中未检测到 ob 基因的表达，提示卵巢本身并不产生 LEP，卵泡液中的 LEP 来源血清8。表 3 大鼠卵巢中 ObR mRNA 实时荧光相对定量 PCR 结果LEP 作为一种旁分泌因子，通过其受体直接作用于卵巢颗粒细胞而参与卵巢功能的调节，因此笔者考虑 PCOS 卵巢的
11、改变可能与 LEP 及其受体的异常调控存在某些联系。Panidis 等研究发现，PCOS 可能与循环 LEP 水平的异常调节有关，PCOS 妇女的生殖功能可能比相同体质量的无 PCOS 的正常妇女更易受 LEP 的影响9；另外,在 PCOS 患者的卵巢，可能存在固有的 LEP 反应异常，这种异常可能是由于其卵巢内的分泌异常，或受体水平、受体后信号传导的单个或多个内在缺陷所致靶细胞对 LEP 反应异常，故 ObR 在卵巢内的作用可能有更深远的意义。本实验采用来曲唑诱导建立 PCOS 大鼠模型。来曲唑为一种非甾体类芳香化酶抑制剂，它能使 T 和雄烯二酮在芳香化酶的作用下转变成雌二醇和雌酮的过程受到抑制，导致雄激素水平升高并发展为多囊卵巢10。结果表明，
