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1、Molecular Biology,第一章 绪 论,分子生物学,本章主要内容,一、分子生物学的基本含义,二、分子生物学的主要研究内容,三、分子生物学的发展简史,四、分子生物学在兽医上的应用,Why?,一、分子生物学的基本含义,是从分子水平研究生命本质，以核酸和蛋白质等生物大分子的结构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作用为研究对象的一门新兴学科。,二 、分子生物学研究内容, DNA重组技术（基因工程） 基因的表达调控 生物大分子的结构和功能研究(结构分子生物学） 基因组、功能基因组与生物信息学研究,（一）DNA重组技术,目的是将不同DNA片段（如某个基因或基因的一部分）按照人们的设计定向连接起来
2、，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响 受体细胞的新的 遗传性状。,以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程,目 录,DNA重组技术,1、可用于定向改造某些生物的基因组结构，提高其经济价值； 2、可被用于大量生产某些在正常细胞代谢中产量很低的多肽 ； 3、可被用来进行基础研究 。,（二）基因的表达调控,信号转导研究 转录因子（transcription factor ）研究 RAN剪接,信号转导研究,转录因子研究,真核生物帽子结构的加入在细胞核内完成，而且是在RNA链开始合成后即加入。,真核基因结构的不连续性,真核基因结构的不连续性,RNA剪辑,RNA剪辑,（三）生物
3、大分子的结构功能研究,生物大分子在发挥生物学功能时，必须具备两个前提： A 它拥有特定的空间结构（三维结构） B 在它发挥生物学功能的过程中，必定存在着结构和构象的变化。,（四）基因组、功能基因组与生物信息学研究,基因组:一个细胞（或生物体）内所有基因的组合 功能基因组学：研究基因组内每个基因的具体功能及其相互关系 蛋白质组计划：后基因组计划，研究蛋白质的组成、功能 生物信息学：以计算机为工具对生物信息进行储存、检索和分析,人染色体及其标准带纹 （常染色体和性染色体）,染色体DNA氨基酸,三、分子生物学简史,20世纪70s以后,20世纪50s至20世纪70s,19世纪至20世纪50年代,改造生
4、命的发展阶段,初步认识生命本质,建立和发展阶段,准备和酝酿阶段,（一）准备和酝酿阶段,产生了两点对生命本质的认识上的重大突破：即确定了蛋白质是生命的主要物质基础和生物遗传的物质是DNA。,蛋白质是生命的主要物质基础,1897年，Buchner兄弟用不含细胞的酵母 提取液，实现了发酵，提出酶是生物催化剂。 1902年Email Fisher证明蛋白质结构 是多肽。 1953年Sanger和Thompson完成了第一 个多肽分子 -胰岛素A链和B链的氨基酸 全序列分析。 1950年Pauling和Corey提出了-角 蛋白的螺旋结构模型。,生物遗传的物质是,基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，,B
5、acterial Strain,Injection,1928 Frederick Griffith &1944 Oswald Avery Transformation of Streptococcus pneumoniae肺炎双球菌转化因子实验,1952年Hershey和Chase证实噬菌体DNA侵染细菌实验,（二）现代分子生物学的建立和发展阶段,1 中心法则的建立和完善,50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说, 成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。,Jacob and Monod,2 蛋白质结构与功能的深入研究,一个碱基突变氨基酸变异蛋白质变异人类疾病 （
6、镰刀性贫血病：谷氨酸缬氨酸）,但是，如果没有分离和富集单一DNA分子的技术，科学家就无法对这类物质进行直接的生化分析。,（三）初步认识生命本质并开始改造生命的深入发展阶段,两大技术保证：,1.DNA的体外切割和连接,1962年Arber 发现限制性核酸内切酶，1967Gellert发现了 DNA 连接酶DNA ligase covalently links two DNA strands,Herbert Boyer, Stanley Cohen 1972年获得第一个重组DNA分子,Herbert Boyer,重组DNA实验中常见的主要工具酶,到目前为止，科学家已经几乎能随心所欲地把任何DNA分
7、子切割成一系列不连续的片段，再利用凝胶电泳技术将这些片段按照分子量大小逐一分开，以供下一步研究。,1972 - Paul Berg,Produced first recombinant DNA using EcoRI,EcoRI recognition sites, phage DNA,EcoRI cuts DNA into fragments,Sticky end,SV40 DNA,The two fragments stick together by base pairing,DNA ligase,Recombinant DNA,仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行DNA的切
8、割和重组远不能满足基因研究的需要。 DNA片段在体外不具备自我复制能力，要想得到足够量和足够纯度的DNA，必须将它们连接到具备自主复制能力的DNA分子上（载体上），并转入寄主细胞中进行繁殖。 这就是基因克隆，或分子克隆 。,分子克隆的载体-具备自主复制能力的DNA分子（vector），如病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。,从此，大肠杆菌就成了分子克隆中最常用的转化受体。,1970年Mandel和Higa发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处理后，能有效地吸收噬菌体DNA。,1972年，Cohen等人又报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞同样能够摄取质粒DNA。,1973 - B
9、oyer, Cohen & Chang,Transform E. coli with recombinant plasmid,Stanley Cohen & Annie Chan,Herbert Boyer,Kanamycin resistance gene,Plasmid pSC101,Tetracycline resistance gene,E. coli transformed with recombinant plasmid,Transformed cells plated onto medium with kanamycin and tetracycline,Only cells w
10、ith recombinant plasmid survive to produce colonies,(1)从此，大肠杆菌就成了分子克隆中最常用的转化受体。,（2）像非洲爪蟾这样的高等生物的基因也可以被成功地转移到原核细胞中并实现其功能表达；,（3）质粒DNA-大肠杆菌细胞作为一种成功的基因克隆体系，有可能在重组DNA或基因工程研究中发挥重要作用。,DNA的核苷酸序列分析技术,DNA核苷酸序列分析法是在核酸的酶学和生物化学的基础上创立并发站起来的一门重要的DNA技术学，这门技术，对于从分子水平上研究基因的结构与功能的关系，以及克隆DNA片断的操作方面，都有着十分广泛的使用价值。,四、分子生物
11、学的应用,品种改良,转基因牛 作为生物反应器 改善牛奶的品 质，提高酪蛋白 含量 转入生长激素基 因，提高产奶量,转基因羊 获得人的凝血酶原激活剂、凝血因子、尿激酶等。 改变羊毛的颜色。,转基因猪 生长激素基因 人的血红蛋白基因,提高畜牧业的生产力发展水平,分子生物学在兽医中的应用,分子生物学技术在中兽医基础理论中的应用,阴阳学说与分子生物学技术 阴阳学说贯穿于中兽医学理论体系的各个方面。对分子生物学的主要研究对象核酸和蛋白质及与其密切相关的细胞核和细胞质进行了阴阳属性的划分。核酸属阴，蛋白质属阳；胞核属阴，胞质属阳。 近几年来，我国对cAMP、cGMP与中兽医阴阳学说进行了研究。李芳生报道，
12、阳虚者cAMP水平升高；阴虚者cGMP水平升高。进一步分析cAMP、cGMP与阴虚和阳虚的关系可知，阳虚者表现副交感神经系统活动加强；阴虚者主要表现交感神经系统活动加强。这些研究都为推动中医理论向现代化迈进有重要意义。 素问至真要大论中说“谨察阴阳所在而调之，以平为期”，是中医临床诊断和治疗的基本原则。与此理论相一致，分子生物学技术研究发现，正常细胞染色体上存在非活化状态的原癌基因，同时还存在抑癌基因。如前者激活，基因异常表达；或后者缺失而不能发挥正常细胞生长调节和终止分化作用，就可导致肿瘤发生，这说明原癌基因与抑癌基因两者平衡失调对肿瘤发生起着重要作用。,脏腑学说与分子生物学技术,脏腑学说是
13、研究动物机体各脏腑器官的生理活动、病理变化及其相互关系的学说。 肾藏精，主命门之火，是机体的先天之本。杨金蓉运用“恐伤肾”原理恐吓母鼠，造成子鼠先天肾气亏虚的动物模型，然后检验子鼠胸腺核酸含量，发现恐吓各组DNA、RNA含量及RNADNA值均有所降低，且恐吓程度越重，降低越明显。王米渠报道受惊吓母鼠所产子鼠大脑皮层厚度变薄，尤以分子层明显变薄，说明围产期紧张情绪直接影响到下一代子鼠的生长发育。用RTPCR技术发现肾阳虚证和下丘脑室旁核促肾上腺皮质激素的mRNA表达受抑，将肾阳虚证定位在下丘脑。脾统血，主运化，是机体的后天之本。王晓明等通过脾气虚证大白鼠模型及其相关抗氧化酶变化研究，提示中医认为
14、“脾为后天之本”在生理上同分子生物学水平的抗氧化酶活性和(含量)的正常，对中医“脾”的本质的现代化科学解释有一定的学术意义。这一切都说明中医脏象学说是有分子生物学基础的。,中兽医证的研究与分子生物学技术,中兽医中的同病异治、异病同治在分子生物学上的体现就是将同一疾病不同证候和同一证候不同疾病的动物进行基因图谱表达，观察分析其基因突变、异常表达同疾病的关系。从中西医结合的角度，中医证本质的含义是指引起证发生发展的物质基础，这些物质决定着证的动态变化过程。 分子生物学对于蛋白质研究的突破将为证候与蛋白质的结合研究奠定基础，在这一方面，有关蛋白质芯片的深入研究和纳米技术的使用将为蛋白质的研究与中医证
15、候的研究提供发展的契机。而证候一基因组学也是中医现阶段研究的一个重要课题，将宏观的中医证候与微观的基因功能相联系。为中医证候的现代化研究提供了新的探索路径。,发现“阳虚”动物骨髓细胞DNA合成率下降，认为中医肾主骨生髓藏精理论与促进核酸蛋白质代谢有关。 通过对中药抗衰老作用机制的研究发现端粒长度缩短与衰老有关。端粒是线形染色体末端的特殊结构，含有DNA高度重复序列，随着细胞的衰老，血液及结肠黏膜细胞中端粒的平均长度在不断减少，抗衰老中药的作用可能表现在对端粒DNA重复序列有保护作用。而中药通过提高DNA的修复能力、清除自由基、增强神经生长因子(NCF)受体等作用来达到抗衰老之目的。,分子生物学
16、技术在中药研究中的应用,1994年，Wilkins和Williams首先提出了蛋白质组。化学蛋白质组学是利用化学小分子直接从功能角度切入蛋白质组的研究，通过化学小分子处理前后的差异蛋白质组展示，研究蛋白质的翻译后修饰过程。这种研究模式为中药对机体的作用机制提供了研究平台。 分子生物学技术应用于中药药理的研究开始于中药单体的研究，集中于人参三醇皂苷、云芝多糖等中药单体对细胞内相关因子及受体mRNA转录、基因表达上有调控作用。对于中药复方的研究尚处于起步阶段。我国学者曾对人参、黄芪、青蒿、淫羊藿、银耳、灵芝等药物对体内重要的细胞因子(ILl、IL一2、IL一3、IL一6、TNF等)的基因表达调控机体的免疫反应做了探讨。曹颖英等应用斑点杂交法研究表明，淫羊藿苷(ICA)可促进刀豆蛋白(ConA)诱导的淋巴细胞IL一3 m
