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1、PCR反应的模板,重组质粒DNA 基因组DNA RNA 菌落,图 1 口腔腺中提取的RNA M: DL2000 marker; 1: 5 L RNA; 2: 10 L RNA; 3: 15 L RNA.,M 1 2 3,28S,18S,5S,2019/3/2,4,第七章 PCR技术及其应用,一、PCR技术原理 二、PCR技术的主要类型 三、PCR技术应用,2019/3/2,5,PCR技术简史,DNA的复制 DNA变性与复性 聚合酶链反应的发明,解链酶,一、 PCR技术原理,2019/3/2,6,PCR技术简史,DNA的复制 DNA变性与复性 聚合酶链反应的发明,引物酶,引物酶,2019/3/2
2、,7,PCR技术简史,DNA的复制 DNA变性与复性 聚合酶链反应的发明,DNA 聚合酶,DNA 聚合酶,2019/3/2,8,PCR技术简史,DNA的复制 DNA变性与复性 聚合酶链式反应的发明,2019/3/2,9,PCR技术简史,DNA的复制 DNA变性与复性 聚合酶链反应的发明,2019/3/2,10,PCR技术简史,DNA的复制 DNA变性与复性 聚合酶链反应的发明,2019/3/2,11,DNA polermases for PCR:,Thermus aquaticus,古细菌-水生栖热菌,2019/3/2,12,Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus),酶活性(
3、%),温度(),40 50 60 70 80 90 100,100 80 60 40 20,2019/3/2,13,引物,引物,Mullis的构思,DNA聚合酶,DNA聚合酶,特定DNA片段,2019/3/2,14,72,94,55,PCR循环,2019/3/2,15,PCR技术简史,DNA的复制 DNA变性与复性 聚合酶链反应的发明,PCR的基本原理,类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适
4、条件下的这种循环的不断重复。,2019/3/2,16,2019/3/2,17,PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (95),2019/3/2,18,Target Sequence,Target Sequence,PCR原理示意图,模板DNA的变性：模板DNA经加热至93-95左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备；,PCR Cycle - Step 2 Temperature is lowered (Tm ) and primers annea
5、l to target sequences,2019/3/2,19,Target Sequence,Target Sequence,Primer 1,Primer 2,5,3,5,5,3,5,3,3,模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；,PCR Cycle - Step 3 - At 72 Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporated,2019/3/2,20,Target S
6、equence,Target Sequence,Primer 1,Primer 2,5,3,5,5,3,5,3,3,Taq DNA Polymerase,引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链。,End of the 1st PCR Cycle Results in two copies of target sequence,2019/3/2,21,Target Sequence,Target Sequence,每完成一个循环需24分钟， 23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百
7、万倍。,2019/3/2,22,被扩增的DNA片段,模板 DNA 变性 引物与模板退火,引物延伸,模板DNA变性 引物与模板退火 引物延伸,引物延伸,循环1,循环2,循环3,模板 DNA 变性 引物与模板退火,212,224,238,25次循环后，被扩增的DNA片段的拷贝数为 225 附图,Target Amplification,Target Amplification,2019/3/2,23,No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 20 1,048,576 30 1,073,741,824
8、,1 cycle = 2 Amplicon,2 cycle = 4 Amplicon,3 cycle = 8 Amplicon,4 cycle = 16 Amplicon,5 cycle = 32 Amplicon,6 cycle = 64 Amplicon,7 cycle = 128 Amplicon,2019/3/2,24,PCR反应体系,缓冲溶液(Mg2+是DNA聚合酶的激活剂) 耐热DNA聚合酶 脱氧核糖三磷酸核苷酸 (dNTPs) 模板DNA或cDNA 上游引物、下游引物,2019/3/2,25,（1）PCR反应缓冲液,Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 1.5mmol/L-2.5mm
9、ol/L反应体系。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。,2019/3/2,26,（2）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-5 U/100L 酶量增加使反应特异性下降; 酶量过少影响反应产量。,2019/3/2,27,（3）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等,一般为50-200mol/L 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下
10、降，影响DNA聚合酶的活性。,2019/3/2,28,（4）模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。,2019/3/2,29,（5）引物浓度 0.1-1mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。,PCR引物的设计一般原则,引物长度一般以1530bp为宜,过短则降低特异性，过长则会引起引物间退火而影响有效扩增。 避免引物内部出现二级结构，避免序列内有较长的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。 G/C和A/T碱基均匀分布，G/C含量在4555%之间，引
11、物碱基序列尽可能选择碱基随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶连续排列。,2019/3/2,30,要避免两个引物间特别是3末端碱基序列互补以及同一引物自身3末端碱基序列互补的，使它们不能形成引物二聚体或发卡结构。 引物3末端碱基一般应与模板DNA严格配对，并且3末端为G、C或T时引物效率较高。 引物5末端碱基可不与模板DNA匹配，可添加与模板无关的序列(如限制性核酸内切酶的识别序列、ATG起始密码子或启动子序列等)，便于克隆和表达，但其保护碱基有一定的要求。 引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。,2019/3/2,31,2019/3/2,32,例 1. 引物的 3 末端形成杂交 5 GGCTATACC
12、GATTCGAATCA 3 3 ACTAAGCTTAGCCATATCGG 5 例 2. 引物的 5 末端形成杂交 5 ATCGATCGATGGCATGGTAT 3 3 TATGGTACGGTAGCTAGCTA 5 例 3. 引物的中间部分形成杂交 5 AACGAGCTTCGAAGGCTAA 3 3 AACGAGCTTCGATGGCTAA 5 例 4. 5 CCAGAGGGAGAACTCCCTCGC 3 引物设计软件：Primer 5, Oligo6,目的基因上游引物设计,目的基因下游引物设计,2019/3/2,41,PCR一般循环参数 变性 使双链DNA解链为单链,95 35分钟 (2)退火
13、温度由引物长度和GC含量决定, 适宜的退火温度大约低于引物Tm值45-55 ，介于45-55 。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。,Tm值就是DNA熔解温度，指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度。 Tm（）（）,2019/3/2,42,（3）延伸 72，延伸时间由扩增片段长度决定 （4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低错误掺入率增加,标准的PCR反应条件：,10缓冲液 10 L 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 各10100pmol 模板DNA 0.12g Taq DNA聚合酶 2.5U Mg
14、2+ 1.5mmol/L,2019/3/2,43,2019/3/2,44,PCR仪,2019/3/2,45,模板DNA,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,2019/3/2,46,引物1,引物2,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,2019/3/2,47,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,2019/3/2,48,第1轮结束,第2轮开始,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,2019/3/2,49,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反应条件 P
15、CR过程 PCR的特点,2019/3/2,50,第2轮结束,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,2019/3/2,51,模板DNA,第1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,第6轮扩增,理想拷贝数=2n n 循环次数 实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数,附图,PCR反应注意的事项,（一）防止污染 试剂小量分装 吸头及EP管一次性使用 器皿及工作区域要分开，无菌操作 （二）设立对照： 阳性对照： 阳性模板 阴性对照： 阴性模板 试剂对照： 除模板外的所有组分,2019/3/2,52,PCR反应的特点,灵敏度高 皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平 能从100万个细胞中检出一个靶细胞 病毒检测的灵敏度可达3个RFU（空斑形成单位） 细菌检测的最小检出率为3个细菌 简便、快速 一次性加好反应液，24 h完成扩增 扩增产物一般用电泳分析 对标本的纯度要求低 血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA,2019/3/2,53,空斑形成单位又称蚀斑形成单位，是计量病毒（或噬菌体）的一种单位，但只限于用在有产生空斑能力的病毒。其原理是：用少量有破坏宿主细
