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1、1,蛋白质的性质及研究方法,肌红蛋白晶体,2,蛋白质的理化性质,紫外吸收:最大吸收峰为280nm 两性解离:蛋白质的pI值不能直接计算,只能使用等电聚焦等方法进行测定 胶体性质 沉淀反应:盐析、pI 沉淀、有机溶剂引起的沉淀和重金属盐作用造成的沉淀 变性、复性 水解 颜色反应,3,蛋白质变性,蛋白质受到某些理化因素的作用,其高级结构受到破坏、生物活性随之丧失的现象。 导致蛋白质变性的物理因素有:加热、冷却、机械作用、流体压力和辐射;化学因素有强酸、强碱、高浓度盐、尿素、重金属盐、疏水分子和有机溶剂。 蛋白质变性以后,其理化性质发生一系列的变化。这些变化可以作为检测蛋白质变性的指标。主要的变化包
2、括:(1)溶解度降低。(2)粘度增加。(3)生物活性丧失。(4)更容易被水解。(5)结晶行为发生变化。,4,蛋白质的水解,蛋白质在强酸、强碱或蛋白酶的催化下均能够发生水解。但需要注意的是,酸水解会破坏几种氨基酸,特别是Trp几乎全部被破坏,其次是三种羟基氨基酸。另外Gln和Asn在酸性条件下,容易水解成Glu和Asp。酸水解常用硫酸或盐酸,使用最广泛的是盐酸;碱水解会导致多数氨基酸遭到不同程度的破坏,并且产生消旋现象,但不会破坏Trp;酶水解效率高、不产生消旋作用,也不破坏氨基酸,但由于不同的蛋白酶对肽键特异性不一样,因此,由一种酶水解获得的通常是蛋白质的部分水解产物。,5,四种羧肽酶来源和特
3、异性,6,几种蛋白酶特异性的比较,7,蛋白质的各种颜色反应,8,蛋白质研究方法,假定你发现一种新的蛋白质:蛋白质X 1. 如何得到这种蛋白质? 蛋白质的分离、纯化技术 2. 这种蛋白质的大小? (SDS-PAGE) 3.它的pI是多少? (等电聚焦) 4. 其他细胞或其他生物体内是否存在? (Western印迹) 5. 其一级结构如何? (序列分析) 6.其三维结构又如何? X-射线衍射和核磁共振,9,蛋白质纯化,一、准备工作 要解决三个问题: (1)纯化蛋白质的目的;(2)目标蛋白的测活方法;(3)纯化蛋白质的原料。 二、纯化步骤: (1)破碎细胞或组织(混合和匀浆);(2)去除残渣(离心); (3)沉淀/浓缩(硫酸铵或聚乙二醇);(4)纯化(层析); (5)鉴定,10,11,等电聚焦需要在凝胶中加入两性电解质,以在阳极和阴极之间建立递增的pH梯度,处在其中的蛋白质分子在电场的作用下迁移,最后各自移动到并聚焦于与其pI相当的pH位置上。于是通过等电聚焦,不仅可以实现pI不同的蛋白质之间的分离,而且还可以测定出各种蛋白质的pI,12,蛋白质的双向电泳,13,Western印迹,14,蛋白质一级结构的测定,直接测定法 间接测定法。 先得到某一种蛋白质基因的核苷酸序列,然后根据通用的遗传密码表间接推导出由其决定的氨基酸序列。,15,蛋白质一级结构测定的主要步骤,