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1、液相色谱基础知识,第一节 色谱法概述 第二节 液相色谱法 第三节 液相色谱图相关术语 第四节 HPLC的主要类型及原理,第一节 色谱法概述,一、色谱法简介 二、色谱法的定义和分类 三、气相色谱和液相色谱的区别 四、色谱法的分离原理,关于色谱,色谱是一种分离工具，而不是传统意义上的分析仪器 常见的分离方式： 蒸馏、离心、电泳、过滤、超滤 等等,色谱 是其中一种分离工具,一、色谱法简介,色谱法（Chromatography）溯源 俄国科学家Tswett 1903年发现色谱的吸附原理，开创了应用吸附原理分离植物色素的新方法并见诸于俄文的文献 1906年正式命名（见诸文献） 色谱法；Chromatog
2、raphy 50年代开始广泛研究和应用 主要是气相色谱及薄层色谱 高效液相色谱法的广泛应用始于70年代,色谱的发明人,俄国科学家：M. S. Tswett 正式命名“色谱”的文献,色谱起源,经典液相色谱,二、色谱法的定义和分类,色谱法的定义： 色谱法又称色层法或层析法，是一种利用不同溶质(样品)与固定相和流动相之间的作用力(分配、吸附、离子交换等)的差别，当两相做相对移动时，各溶质在两相间进行多次“平衡”，使各溶质达到相互分离的方法。,固定相：在色谱分离中固定不动、对样品产生保留的一相。 流动相：在层析过程中推动固定相上的物质向一定方向移动的液体或气体。,色谱法的分类 根据流动相的状态将色谱法
3、分成四大类。,1.按两相分子的聚集状态分类,2. 按固定相的固定方式分类,平面色谱,3.按分离机制分类,流动相 固定相 类型 液体 固体 液-固色谱 液体 液体 液-液色谱 气体 固体 气-固色谱 气体 液体 气-液色谱,液相色谱,气相色谱,三、液相色谱与气相色谱的比较,液相色谱所用基本概念与所用基本理论均与气相色谱一致。但由于在液相色谱中以液体代替气相色谱中的气体作为流动相，而液体和气体的性质不相同；此外，液相色谱所用的仪器设备和操作条件也与气相色谱不同，所以，液相色谱与气相色谱有一定差别。,（1）应用范围不同 气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。对高沸点化合物、非挥发性物质、
4、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、分析较为困难；而液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性的限制，它非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析。,（2）液相色谱能完成难度较高的分离工作 气相色谱的流动相载气是惰性的，不参与分配平衡过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互作用。而在液相色谱中流动相液体也与固定相争夺样品分子，为提高选择性增加了一个因素。,液相色谱固定相类型多，如离子交换色谱和排阻色谱等，作为分析时选择余地大；而气相色谱是不可能的。 液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般有利于色谱分离条件的选择。,四、色谱法的分离原理,1
5、液固色谱法 分离原理：使用固体吸附剂，根据固定相对样品组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附解吸附的平衡过程。 吸附剂：为硅胶或氧化铝，粒度5-10m。 适用对象：适用于分离分子量200-1000的组分，大多数用于非离子型化合物，常用于分离同分异构体。,2液液色谱法 使用将特定的液态物质涂于基质表面，或化学键合于基质表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。,液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。 正相色谱法 采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极
6、性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物。,反相色谱法 一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。,正相色谱法与反相色谱法比较表,第二节 液相色谱法,一、液相色谱的分类 二、高效液相色谱的特点 三、高效液相色谱法的仪器配置 四、高效液相色谱的基本流程 五、高效液相色谱的应用,液相色谱的分类,根据固定相的使用形式将液相色谱分成以下几类： 1.柱色谱：固定相装在玻璃管或金属
7、管内，或涂在柱内壁上。又分为填充柱色谱和空心毛细管色谱两种类型。 2.纸色谱：用滤纸做载体，吸附在滤纸上的水为固定相，试样溶液在纸上进行展开、分离。 3.薄层色谱：将固定相均匀地涂铺在玻璃板或塑料板上，样品的展开、分离在玻璃板或塑料板上进行。,4.高效液相色谱,High Performance Liquid Chromatography 高效液相色谱法，简称：HPLC 是一种区别于经典液相色谱；基于仪器方法的高效能分离手段。 广泛应用于各个领域： 医药 / 环保 / 石化 / 生命科学 / 食品及农业 在技术，理论及应用上仍处于发展阶段,HPLC的特点,高压压力可达150-300 Kg/cm2
8、。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。 高速流速为0.1-10.0 ml/min。 高效可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。 高灵敏度紫外检测器灵敏度可达0.01ng，同时消耗样品少。,HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：,速度快通常分析一个样品在15-30 min。 分辨率高可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。 柱子可反复使用用一根色谱柱可分离不同的化合物。 样品量少，容易回收样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。,HPLC的仪器配置,色谱泵,自动进样器,色谱柱及柱温箱,检测器,数据处理系统,溶剂,一、高压输液系统 高压输液系统由 溶剂贮存器、高
9、压泵、梯度洗脱装置和压力表等组成。,1.溶剂贮存器 溶剂贮存器一般由玻璃、不锈钢或氟塑料制成，容量为1到2 L，用来贮存足够数量、符合要求的流动相。,2.高压输液泵 高压输液泵是高效液相色谱仪中关键部件之一，泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性。其功能是 将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。,泵应具备的性能： 1.流量稳定； 2.流量范围宽：分析型应在0.1-10mL/min范围内连续可调，制备型应能达到100mL/min； 3.输出压力高：一般应能达到150-300kg/cm2； 4.液缸容积小: 便于清洗和更换流动相； 5
10、.耐腐蚀,密封性好。,高压输液泵，按其性质可分为恒压泵和恒流泵两大类。 恒流泵是能给出恒定流量的泵，其流量与流动相粘度和柱渗透无关。 恒压泵是保持输出压力恒定，而流量随外界阻力变化而变化，如果系统阻力不发生变化，恒压泵就能提供恒定的流量。,泵的使用和维护注意事项,防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。,流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应保留在泵内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。,泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产生漏液。 输液泵的
11、工作压力决不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏液。 流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果有大量气泡，泵就无法正常工作。,3. 梯度洗脱装置 等度洗脱：在同一分析周期内流动相组成保持恒定，适用于组分数目较少，性质差别不大的样品。 梯度洗脱：就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。,梯度洗脱装置分为两类： 一类是外梯度装置（又称低压梯度），流动相在常温常压下混合，用高压泵压至柱系统，仅需一台泵即可。 另一类是内梯度装置（又称高
12、压梯度），将两种溶剂分别用泵增压后，按电器部件设置的程序，注入梯度混合室混合，再输至柱系统。,二、进样系统 进样系统包括进样口、注射器和进样阀等，它的作用是把分析试样有效地送入色谱柱上进行分离。,三、分离系统 分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。色谱柱是色谱系统的心脏，对色谱柱的要求是柱效高、选择性好、分析速度快等。,柱的构造 色谱柱由柱管、压帽、密封圈、筛板、接头、螺丝等组成。 柱管多用不锈钢制成，也可采用厚壁玻璃或石英管，管内壁要求有很高的光洁度。 色谱柱两端的柱接头有筛板，是烧结不锈钢或钛合金。,色谱柱的尺寸规格 1.常规分析柱：内径2-5mm,柱长10-30cm; 2.窄径柱：内
13、径1-2mm,柱长10-20cm; 3.毛细管柱：内径0.2-0.5mm; 4.半制备柱：内径5mm; 5.实验室制备柱：内径20-40mm,柱长10-30cm； 6.生产制备柱：内径达几十厘米。,柱的使用和维护 1.避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动； 2.应逐渐改变溶剂的组成； 3.一般来说色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质； 4.选择适宜的流动相,以避免固定相被破坏； 5.避免将基质复杂的样品直接注入柱内，需要对样品进行预处理或在进样器和色谱柱间连接保护柱。,四、检测器 检测器是液相色谱仪的关键部件之一。对检测器的要求是：灵敏度高，重复性好、线
14、性范围宽、死体积小以及对温度和流量的变化不敏感等。 在液相色谱中，有两种类型的检测器，一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或物理化学特性有响应。属于此类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等；另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理和化学性质响应。属于此类检测器有示差折光检测器等。,1.紫外吸收检测器 （UV） 是基于溶质分子吸收紫外光的原理设计的检测器。因为大部分常见有机物质和部分无机物质都具有紫外吸收性质，所以该检测器是液相色谱中应用最广泛的检测器，几乎所有液相色谱仪都配置了这种检测器。,2.二极管阵列检测器（diode-array detector, DAD） 以光电二极管阵列作
15、为检测元件的UV-VIS检测器，它可构成多通道并行工作，同时检测由光栅分光，再入射到阵列式接受器上的全部波长的信号，然后，对二极管阵列快速扫描采集数据，得到的是时间、光强度和波长的三维谱图。,DAD是HPLC检测技术的重大进展。采用这种检测器可以瞬间实时对流出液进行全光谱检测, 使HPLC能提供的信息量大幅度增加。换句话说, 在一次色谱操作中, 可同时获得吸光值、流出时间和各组分的紫外-可见光谱图在一起的三维谱图, 提供既定量又定性的色谱信号。,样品池,二极管阵列,光栅,D2 / W 灯,每一组分可在每一波长处得到一吸光度值,多波长检测三维色谱图,紫外检测器和DAD检测器的区别： 普通UV-V
16、IS检测器是先用单色器分光，只让特定波长的光进入流通池。而二极管阵列UV-VIS检测器是先让所有波长的光都通过流通池，然后通过一系列分光技术，使所有波长的光在接受器上被检测。,3.示差折光检测器 是目前液相色谱中常用的一种检测器，它可连续检测参比池流动相和样品池中流出物之间的折光指数差值，这一差值和样品的浓度成比例关系。某些不能用选择性检测器检测的组分，如高分子化合物、糖类、脂肪烷烃等，可用示差折光检测器检测。,4.荧光检测器 荧光检测器是一种高灵敏的, 选择性检测器, 其灵敏度比UV高10-1000倍, 一般可测ppb级的化合物。它用于检测物质本身具有荧光或为了提高灵敏度将无荧光的物质衍生成荧光体。可用荧光检测的物质：如某些代谢物、食品、药物、氨基酸、多肽、胺类、维生素、石油高沸点馏分、生物碱和甾族化合物等。,糖精钠：学名是邻磺酰苯酰亚胺钠，甜度是蔗糖的200-250倍。除了在味觉上引起甜的感觉
