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1、,1,第十一章 动物基因工程,,2,第一节 基因工程概述,理论上的三大发现 DNA为遗传物质：Avery的肺炎双球菌转化实验 DNA双螺旋结构的发现和DNA半保留复制机制 遗传密码与中心法则,,3,技术上的三大发明 1.限制性内切酶和连接酶：DNA的“手术刀”与“缝纫机” 2.载体：运送遗传物质的工具，如质粒、病毒等 3.逆转录酶：从mRNA到 DNA，使真核基因制备成为可能,,4,,5,,6,,7,,8,,9,,10,,11,,12,3、基因工程的内容 目的基因的获得 目的基因与载体的连接成重组DNA分子 重组DNA分子导入受体细胞 筛选重组克隆 基因表达与产物分离,,13,基因操作中的工具
2、酶 手术刀限制性核酸内切酶、核酸外切酶 缝纫机连接酶 复印机DNA聚合酶、逆转录酶,第二节 基因操作中的工具酶,,14,一、限制性内切酶的概述 （一） 概念 限制性核酸内切酶简称限制性内切酶，是一类能识别双链DNA中特定核苷酸序列并具有专一切割位点的脱氧核糖核酸水解酶。 主要存在于细菌、霉菌中，至今已分离到1000种以上，搞清识别序列的有300种以上。,,15,（二）限制性内切酶命名规则 限制酶的命名从其来源微生物的拉丁名中摘取，即由其属名的第一个字母(大写)与种名的第一、二两个字母(小写)组成酶的基本命名，若酶的产生菌由株系之分，则有4个或4个以上拉丁字母组成，其第四个字母之后表示株系。 如
3、 EcoRI来源于Echerichia.coli RY13 BamHI来源于B.amyloliquefaciens,,16,H in d II,Haemophilus(属名),Influenzae(种名),d(株系),罗马数字,限制性内切酶命名举例,,17,（三）限制性内切酶分类,,18,,19,（四） II 型限制性内切酶的特性 （1）II型限制酶的识别特异性 回文识别序列 II型限制酶的识别序列大多是具有 双重对称结构性结构,或称回文序列 (Palindromic Sequence),,20,（2）识别特定的核苷酸序列，其长度一般为48个核苷酸且呈二重对称。 （3）具有特定的酶切位点，即限
4、制性内切酶在其识别序列的特定位点对双链DNA进行切割，由此产生特定的酶切末端。,,21,识别序列(位点) 双链DNA分子上能识别的特定核苷酸序列 被识别的碱基序列通常具有双轴对称性，即回文序列(Palindromic Sequence)。,EcoR I 的识别序列,,22,二、 DNA聚合酶,（一）DNA聚合酶 (DNA Polymerase)的基本特性 能够将脱氧核糖核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3-OH末端催化核苷酸的聚合作用，而不发生引物从膜版上的解离作用。 DNA-OH DNA-(pdN)n nPPi dATP，dTTP，dCTP，dGTP，Mg2,DNA聚合酶,,23,大肠杆
5、菌 DNA 聚合酶 ,1E.coli DNA 聚合酶 的活性 5-3 DNA 聚合酶活性。 5-3 外切核酸酶活性。 3-5 外切酶活性。,,24,2E.coli DNA 聚合酶 的用途, 利用 E.coli DNA 聚合酶 的 5-3 外切核酸酶活性，可用切口平移法（nick translation ）标记 DNA ，所有 DNA 聚合酶中只有此酶有此反应。 用于 cDNA 克隆中的第二链，即单纯的 DNA 聚合活性。但由于具有 5-3 外切活性，现在已不再使用，而改用 Klenow 酶和反转录酶（详见后面）。 对 3 突出端的 DNA 作末端标记（交换或置换反应），但是此反应用 T4 或
6、T7 DNA 聚合酶效果会更好 。,,25,（二）Klenow DNA 聚合酶,无53外切活性 有聚合活性 有 3 5外切活性 由于没有 5-3外切活性，使用范围进一步扩大,,26,Klenow DNA 聚合酶用途, 补平 3 凹端 DNA 。 抹平 DNA 3凸端。 通过置换反应对 DNA 进行末端标记。 在 cDNA 克隆中合成第二链。 随机引物标记。 应用于 Sanger 双脱氧链末端终止法的 DNA 测序。 应用于 PCR 反应，现在已经被 Taq DNA 聚合酶等取代。 在体外诱变中，用于从单链模板合成双链 DNA 。,,27,（三）T4 噬菌体 DNA 聚合酶,T4 噬菌体 DNA
7、 聚合酶来源于 T4 噬菌体感染的 E.coli ，分子量114kDa 。 T4 噬菌体 DNA 聚合酶与 Klenow 酶相似，但 3-5 外切活性强 200 倍，且不从单链 DNA 模板上替换引物，因此在诱变反应中更有用，诱变率约提高 1 倍。,,28,（五）逆转录酶,逆转录酶是一种有效地转录RNA产生cDNA的酶。产物DNA称cDNA，即互补DNA (complementary DNA)，该酶又称为依赖于RNA的DNA聚合酶(RNA-dependent DNA polymerase)。 逆转录酶在基因工程中的主要用途是以真核mRNA为模板，合成cDNA，用以组建cDNA文库，进而分离为特
8、定蛋白质编码的基因。,,29,（六）末端转移酶,来源于小牛胸腺 催化 dNTP 加于 DNA 分子的 3 羟基端 dNTP 为 T 或 C ，二价阳离子首选 CO 2+；为 A 或 G 首选 Mg 2+ 对 3 羟基突出末端的底物作用效率最高 在 cDNA 或载体 3 末端加同聚尾用于克隆 用标记的 rNTP、 dNTP 或 ddNTP 来标记 DNA 片段的 3 末端。,,30,DNA聚合酶在基因工程中的用途： 1) DNA分子的体外合成 2) 体外突变 3) DNA片段探针的标记 4) DNA的序列分析 5) DNA分子的修复 6) 聚合酶链式反应(PCR)等,,31,三、 DNA连接酶与
9、DNA分子的体外连接,体外DNA片段的连接方式： （1）用DNA连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片段 （2）用T4DNA连接酶将平端的DNA片段连接起来 （3）先在DNA片段的末端加上化学合成的衔接物或接头，使之形成粘性末端之后，再用DNA连接酶将它们连接起来。 注意：1、DNA连接酶不能连接两条单链的DNA分子或环化单链的DNA分子，被连接的 DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。,用于将两段乃至数段DNA片段拼接起来的酶称为连接酶。它催化DNA 5磷酸基与3羟基之间形成磷酸二酯键。,,32,具有3-OH和5-P基团的缺口 被DNA连接酶封闭起来,如果缺失一个或数个核苷酸的裂口 DNA连
10、接酶则不能将它封闭起来,注意：2、连接酶如果缺失一个或数个核苷酸的裂口 DNA连接酶则不能将它封闭起来,,33,四、 其他酶类,1、T4多核苷酸酶,T4 多核苷酸酶催化ATP的 -磷酸基转移至DNA或RNA片段的5-未端。 在基因工程中主要用于： 1) 标记DNA片段的5- 端，制备杂交探针， 2) 基因化学合成中，寡核苷酸片段5- 磷酸化， 3) 用于测序引物的5- 磷酸标记。,,34,2、碱性磷酸酶,碱性磷酸酶的功能是去除DNA或RNA 5- 未端的磷酸基，反应可表示为： 碱性磷酸酶 5p DNA或5p RNA 5HO DNA或5OH RNA 碱性磷酸酶可用于： 1)去除DNA片段5磷酸，
11、以防止在重组中的自身环化，以提高重组效率。 2)在用r-32PATP标记DNA或RNA的5-磷酸前，去除DNA或RNA片段的非标记5-磷酸。,,35,利用碱性磷酸酶 CIP 防止,载体的再环化,pUC19,SacI KpnI SmaI BamHI XbaI SalI PslI SphI Hind III,对接DNA,可通过凝胶电泳纯化靶DNA,3OH,3OH,5”P,5”P,5”P,5”P,3OH,3OH,用T4噬菌体DNA连接酶连接去磷酸化的质粒与靶DNA,3OH,3OH,3OH,3OH,用CIP去除5P,限制性内切酶,3OH,3OH,3OH,3OH,鉴定重组子： 检查a互补能力的丧失情况
12、核酸杂交 对小量制备的质粒DNA进行酶切分析,CIP：牛小肠提取 BAP: 大肠杆菌提取,,36,3、核酸酶 （nuclease）,核酸外切酶：可降解dsDNA中或DNA-RNA中的一条链 核酸内切酶：可切割DNA链中的单链 （1）BAL31 核酸酶（BAL31 nuclease）：来源于交替单胞菌 ，主要活性为 3 外切核酸酶活性，可从线性 DNA 两条链的 3 端迅速去除单核苷酸，随后可从单链 DNA 内部发挥缓慢的内切酶活性，形成截短了的平端双链 DNA 分子（约占 10-20%）以及带有约 5 个核苷酸突出单链的截短分子（约占 80-90%）。对于所形成的单链突出，可用 DNA 聚合酶
13、补平。,,37,（2）Sl 核酸酶（S1 nuclease）,Sl 核酸酶来源于米曲霉，可降解单链 DNA 或 RNA ，是一种单链核酸酶。产生带 5 磷酸的单核苷酸或寡核苷酸双链，对 dsDNA、 dsRNA 和 DNA:RNA 杂交体不敏感。酶浓度大时可完全消化双链，中等浓度可在切口或小缺口处切割双链。 该酶可用于分析 DNA:RNA 杂交体的结构，去掉双链核酸中突出的单链尾从而产生平末端，打开双链 cDNA 合成中产生的发荚环。,,38,（3）脱氧核糖核酸酶 （DNase ）,DNase 来源于牛胰，是内切核酸酶，可优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链或单链 DNA 。在 Mg 2+ 存在下，独立作用于每条 DNA 链，且切割位点随机。在 Mn 2+ 存在下，它可在两条链的大致同一位置切割 dsDNA ，产生平端或 1-2 个核苷酸突出的 DNA 片段。,,39,（4）核糖核酸酶 A （Ribonuclease A 或 RNase A）,核糖核酸酶 A 来源于牛胰，为内切核酸酶，可特异攻击 RNA 上嘧啶残基的 3 端。可除去 DNA:RNA 中未杂交的 RNA 区，可用来确定 DNA 或 RNA 中单碱基突变的位置。广泛用来去除 DNA 样品中的 RNA 。 核糖核酸酶 A 商品制剂可能会污染其它酶（如 DNA 酶），使用前
