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1、免疫组织化学 Immunohistochemistry 参考教材 免疫组织化学实验技术及应用 主编：倪灿荣等,第一章 绪 论,目 录 一、定义和意义 二、发展简史 三、免疫学概念 四、基本类型与原理 五、种类 六、基本过程,一、免疫组织化学的定义及意义 1、定义 免疫组织化学(Immunohistochemistry)，又称免疫细胞化学(Immunocytochemistry)。 已知的标记抗体（或抗原）原位显示细胞或组织内的相应抗原（或抗体）的方法,进行定性、定量、定位检测。原理：抗原、抗体特异性结合,标记化学反应 酶或其他物质标记抗体 抗原-抗体反应 抗原-抗体复合物 呈色化学反应 底物在
2、酶作用下产生有色物质,2、基本理论,3、优点,高特异性 高敏感性 方法步骤统一 形态、机能与代谢相结合,可定性、定位与定量,4、免疫组织化学的意义,（1）肿瘤诊疗 肿瘤组织起源诊断 肿瘤分型诊断 确定肿瘤的良恶性 确定转移性恶性肿瘤的原发部位 指导肿瘤的治疗、判断预后,（2）病原微生物（肿瘤病因）的检查 （3）免疫性疾病的诊断 （4）科学研究,二、发展简史,1、1941：COON首次用荧光标记抗体检测肺炎双球菌 2、1968：中根一穗建立酶标记抗体技术 3、1974年代: sternberger建立PAP技术 4、1975：KoeHler等发明了单克隆抗体 5、1981：许世明建立抗生物素-生
3、物素标记抗体技术（ABC） 6、免疫电镜技术、杂交-免疫细胞化学等 7、新发展：Envision二步法、90年代建立的葡萄球菌A蛋白标记法（SPA）,三、免疫学概念 （一）抗原: 1、定义：刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞,结合抗体或致敏淋巴细胞的物质。,2、抗原的两种特性： 免疫原性（immunogenicity）： 诱生抗体或致敏淋巴细胞的能力。 反应原性（antigenicity）： 与抗体或致敏淋巴细胞特异性结合的能力。,3、抗原决定族（抗原表位）： 特殊的化学活性基团区域,（二）抗体:,1、定义 :机体受抗原刺激后，浆细胞产生的， 与相应抗原特异性反应的球蛋白（免疫球蛋白：Ig）。,2
4、、基本结构:,一“Y”字型的四肽链 重链(heavy chain, H)：两条、完全相同 轻链(light chain, L)：两条、完全相同 二硫键：连接四肽链。 二端:氨基端（可变区，V区） 羧基端（恒定区，C区）,（1）可变区（ variable region, V ）： Ig分子氨基端，Aa的组成和排列顺序有变异，决定了抗体结合的特异性。,（2）恒定区（constant region, C ）： Ig分子的羧基端，Aa组成和排列在同一动物种属中同类抗体比较恒定。具有免疫原性,四、基本类型与原理 （一）直接法（一步法） 原理：,（二）间接法 原理：,（三）非标记抗体酶法,1、酶桥法 ：以
5、第二抗体作桥，任何抗体都未标记,原理：,一抗和三抗来源于同一种属动物的同类抗体,2、PAP法（peroxidase Antiperoxidase,过氧化物酶抗过氧化物酶法）,原理：预先制备PAP复合物,一抗和PAP复合物中的抗体来源于同一种属动物的同类抗体,（四）亲和素-生物素法 亲和素-生物素过氧化物酶法（Avidin Biotin Complex： ABC法） 原理：预先制备ABC复合物,五、分类:按标记物的不同 免疫荧光组织化学 免疫酶组织化学 亲和免疫组织化学 免疫金-银标记技术 免疫双重和多重组织化学 杂交免疫组织化学,六.基本过程,(1) 抗原的提取和纯化 (2)免疫动物或细胞融合
6、 (3)抗体提取与效价检测 (4)标记抗体 (5)细胞与组织切片标本的制备 (6)免疫细胞化学反应和细胞化学显色 (7)观察和记录结果,第二章 组织学制片技术,一、定义和意义 二、方法 三、基本程序 四、免疫组织化学石蜡切片制作,一、定义和意义,（一）概念 将机体的组织、器官做成能在显微镜下观察的标本的技术,（二）意义,1、是组织学、胚胎学、病理学等生命科学研究组织细胞的正常与病理形态结构的主要方法。,2、是显示组织、细胞中某些化学成分、基因的定位分布和含量变化的不可缺少的手段。,二、制片方法,（一）非切片法： 1、定义：不经切片机切片手续制成标本的方法。,2、类型： 整装片（胚胎）：鸡胚 铺
7、片（柔软组织） 涂片（液体） 磨片（骨、牙） 印片（淋巴结）,类型：非切片法、切片,2、类型：根据所用支持剂（包埋剂）的不同，分为：,石蜡切片 冰冻切片 火棉胶切片法,（二）切片法: 1、定义：用切片机(microtome) 切成微米厚的薄片， 制出标本切片的方法,三、基本程序,切片法,2、冰冻切片,取材 冷冻 切片 染色 封片,（一）取材：从人或动物体内取下所需组织材料的过程,1、材料来源,（1）人体材料：手术、活检、尸检,（2）动物材料,来源广泛 大多数动物组织结构与人体相似 有的结构比人类更典型,四、免疫组织化学石蜡切片制作,（1）麻醉： 吸入麻醉：将浸有乙醚或氯仿的棉球连同动物一起放入
8、密闭容器内麻醉。 适用对象：小动物 缺点：乙醚麻醉：肺部充血、呼吸道分泌物增多 注射麻醉：静脉、肌肉或腹腔内注射 麻醉剂：3%戊巴比妥等 适用对象：较大动物 缺点：内脏淤血,2、动物的致死方法,（2）空气栓塞：向动物静脉内注入一定的空气 适用对象：较大动物，如兔、犬 缺点：血管、内脏淤血,（3）断头：用剪刀剪去动物头部 适用对象：小动物，如青蛙、小鼠 （4）其他方法：击头法、断髓法、股动脉放血法等,3、致死原则：,（1）选择合适的致死方法：利于取材和观察 （2）快速致死，避免挣扎,4、取材注意事项,（1）根据实验目的选择动物的种类： 肝脏猪肝、胃狗、卵巢猫 （2）组织材料要新鲜：在心跳未停时即
9、取材固定。 神经系统：10秒钟变性 消化系统上皮：15分钟自溶 亚细胞：变性更快。,（5）组织块大小适宜：结构完整，组织块：小、薄： 1cm 1cm 0.2cm,最厚不能超过0.5厘米 （6）修剪附带的其他组织,（3）选好部位和切面： 胃：胃底；胰腺：胰尾部； 肺：肺门 管性器官:横切，小肠环行皱襞:纵切 头皮:顺毛根纵切，肾脏:纵切（包括皮质和髓质）,（4）避免损伤组织： 避免手拽、有齿镊子夹、刀剪不锋利,（8）保持清洁：尤其是消化管 用生理盐水洗去血液、污物、粘液及食物残渣,（7）防止收缩变形,骨骼肌、神经在离体后：用木刺扎于木板上或将其两端用线捆于小棒上,（二）固定,1、概念：用化学试剂
10、使蛋白质凝固或沉淀，保持其生活状态时的形态结构的过程。 固定剂（液）：用来固定的化学试剂。,2、目的 （1）防止自溶与腐败 （2）维持形态：使细胞内物质凝固或沉淀下来，保存各种抗原成份原有的结构 （3）利于切片：增加硬度 （4）利于鉴别和观察：使细胞内成分产生不同 的折光率 （5）利于染色：媒介作用，使细胞各部易于受色,3、固定剂,（1）固定剂的必备特性 渗透力强 迅速使组织及细胞成分凝固或沉淀,不致使组织过度收缩与膨胀,能使组织获得较佳的折光率,（2）固定剂的种类 按作用原理分： 凝固性：甲醛，重铬酸钾,沉淀性：酒精、升汞等,按化学性质分,还原剂：醛类、醇类 氧化剂：锇酸、重铬酸钾 酸类：苦
11、味酸、醋酸,单一固定剂：一种试剂组成 只对细胞的某种成分固定得较好，不能将所有的成分都保存下来,混合固定剂：两种以上的试剂组成,按组成成分,（3）常用单一固定剂的性质及用法,名称,福尔马林,（甲醛）,性质概要,1、无色、刺激味的液体。还原剂，凝固蛋白质。 2、保存脂类、糖，线粒体及高尔基体的固定剂。 3、硬化剂，冰冻切片的优良固定剂。,对染色的影响,固定后的处理,硬化程度,其他,常用的单纯固定剂，对细胞的保存好。甲醛能与任何比例的水、醇及乙醚混合。,渗透速度及小块组织（2mm3）固定时间,较快 412小时,适度,可入70%酒精或水冲洗,对苏木素着色好，对伊红着色困难。,收缩与膨胀情况,收缩较小
12、，脱水会使收缩变大。,名称,性质概要,对染色的影响,固定后的处理,硬化程度,其他,渗透速度及小块组织（2mm3）固定时间,重铬酸钾,1、橙红色结晶体，有毒、氧化力极强，能溶于水，不溶于醇，凝固蛋白质 2、保存类脂体，线粒体的固定剂，溶解染色质。,较快，24小时,在切片技术中是良好的药品,收缩与膨胀情况,起初收缩不显著，组织经酒精脱水会继续收缩,中等,用水冲洗,对酸性染料着色很好,（4）混合固定剂的优点及配制原则,优点：取长补短 原则：相互弥补 快+ 慢 胀+ 缩,(5)常用混合固定剂 A、F液（酒精+ 甲醛） 组成：无水酒精90毫升，40%甲醛10毫升 特点：简单、皮下组织铺片、肥大细胞固定好
13、、对弹性纤维、胶原纤维染色好,Carnoy液,组成：冰醋酸1份，氯仿3份，无水酒精6份,特点：快、用于糖原、神经细胞尼氏体、细胞内DNA、RNA固定。,Bouin液,组成：饱和苦味酸水溶液，40%甲醛，冰醋酸。（15：5：1）,特点：常用，固定时间1224小时，适用于大多数组织，以细胞核、细胞分裂为好，对肾脏固定不好。现配现用,Zenker S液,组成：重铬酸钾2.5克，升汞5克，蒸馏水100毫升 贮备液：棕色瓶保存，临用前加冰醋酸5毫升。,特点：常用，固定时间1224小时，水冲洗，加碘去汞，细胞核、细胞质染色好。,（5）固定的方法 灌注法：经血管途径将固定液灌注到所需要固定的器官（超微结构）
14、 类型：心插管固定；股动脉插管灌注 浸泡法：组织直接浸泡在固定液中。 固定液的量：足够、组织块大小的1530倍，瓶底垫纱布 微波固定：固定的组织收缩小 蒸汽固定：避免可溶性成分在固定液中丢失，对人危害大,（6）组织固定后的变化,体积改变：胀或缩,酒精、升汞、苦味酸 缩小,重铬酸钾、醋酸膨胀,硬度增加： 酒精、甲醛增加多 锇酸、苦味酸增加较少,抗张力增加,折光率增加 着色性增加,（7）固定注意事项,标本大小适宜：组织块体积：1cm 1cm 0.2cm 标本固定要及时 最好在低温下固定,固定液的选择要合理,固定液配制要新鲜(除贮存液外，要现配现用） 固定液的量要足够：组织块大小的1530倍，瓶底垫
15、纱布。,固定时间适当：避免太长、太短。,固定后要彻底冲洗,（三）洗涤和脱水,1、洗涤,（1）目的,去除固定液，终止固定作用， 去除固定剂的重金属离子或颗粒,（2）原则,什么配的固定剂就用什么洗（苦味酸固定的，用低浓度乙醇洗），固定剂为酒精或酒精混合液可不洗,洗涤时固定时,特殊成分加特殊洗涤剂：脱黄（70%乙醇）， 碘酊脱贡（固定液含升汞的），硫代硫酸钠脱碘,2、脱水,（1）概念：用化学试剂将标本中的水置换出来的过程,（2）目的： 利于浸蜡（水不能与石蜡等包埋剂混合）,利于组织的永久保存（水使组织分解）,（3）脱水剂,脱水剂的特性,与水任意混合，也能与透明剂混合的液体,脱水剂的类型,单纯脱水剂
16、如：酒精、丙酮等 脱水兼透明的脱水剂 如：正丁醇等 最常用：酒精，缺点：组织硬化和变脆（尤其是高浓度酒精）。,（4）酒精脱水,原则：,循序渐进，酒精浓度逐步增大,柔软组织、胚胎组织:30%开始,暂不包埋的组织:70%80%的酒精保存 更换乙醇:吸水纸吸去组织块表面的水,脱水时间：组织种类、体积大小而定 (一般624小时）,（四） 透明,2、目的：便于浸蜡包埋,1、定义：用一种既可与脱水剂相容又能和 石蜡相容的物质置换脱水剂，组织块呈现透明状态。,3、透明剂：透明所用的药剂,透明剂：,苯、甲苯、二甲苯、香柏油、丁香油等,常用：二甲苯、香柏油,（1）二甲苯,优点：透明力强，作用快。,缺点：容易使组织收缩、变硬、变脆。,注意：先经1/2纯酒精+1/2二甲苯混合液过度，再进二甲苯，二甲
