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1、现在几乎每天都会有文章对各种小RNA与机体发育之间关系的进展进行报道。而精明的生物技术公司也正在以惊人的速度积极地将RNAi的相关知识运用于药物筛选研究。借助现,今先进的测序技术，人们鉴定出了多种新型小RNA，而随后，它们的强大功能将会继续吸引我们研究下去，相信研究结果一定会让我们感到惊喜。 双链RNA能够以序列特异性,的方式导致基因沉默的机制自发现起就对生物学的发展产生了巨大影响，它揭示了人们以前未曾注意到的基因表达调控机制。这种机制被称为RNA干扰（RNAi）或者RNA沉默,（RNAsilencing）。其核心内容是：一些非编码小RNA分子（smallnon-codingRNA，2030n
2、t）进入细胞后与序列互补的信使RNA靶标配,对，阻止其表达。2004年9月，自然首次刊登了美国科学家AndrewZ.Fire与llo等人撰写的关于RNA干扰的成果文章。时隔不久，RNAi技术取得了非凡,的成就。人们逐渐意识到，RNAi将会对生物学的发展带来深远的影响。毫无疑问，打开了RNAi这一潘多拉盒子的AndrewFire与CraigMello获得了200,6年的生理学或医学诺贝尔奖。诺贝尔委员会成员GoranHansson在该年的颁奖词中说道：“RNAi为我们了解生命提供了新视角，并为医学发展提供了新工具。”不过,，RNAi的故事才刚刚开始，许多悬念有待人们逐个解开。 细胞内表达的长ds
3、RNA或外源性长dsRNA（可以是由正链转录产物和负链转录产物配对而成的结构，也可以,是ssRNA内形成的茎环结构）在Dicer酶的作用下降解成小RNA；小RNA的双链解开，其中一条链被优先装载入RNA诱导沉默复合物（RISC）中；装载了小RNA,的RISC复合物就会在细胞内积极地“搜索”转录组，探寻潜在的RNA靶分子。被装载入RISC复合物当中的向导链（guidestrand）-ssRNA随后引导RI,SC复合物当中的核酸内切酶（有时被称作“切割机”，现在人们知道它是Argonaute蛋白）反复剪切拥有向导链同源序列的mRNA靶分子。向导链就是通过这种方式来发,挥特异性的RNAi作用的； 尽
4、管不同生物体内，参与RNAi途径的蛋白和相关机制各有不同，但是它们的干扰策略却惊人地一致。在所有被研究过的物种中，RNAi都,包含两种主要的组成成分，即决定干扰特异性的小RNA和发挥抑制作用的Argonaute蛋白。 根据RISC复合物中Argonaute蛋白的天然活性以及小RNA与,其靶标mRNA之间互补程度的不同，RISC复合物与靶标mRNA结合后会发挥几种不同的作用，它可以控制mRNA的稳定性和蛋白质合成、维持基因组完整性，或产生一系列,特异性的小RNA。随着高通量测序技术的出现以及生物信息学的不断进步，科研人员得以对小RNA的起源及其靶向机制开展更深入的研究。他们发现，在各个不同的物种
5、当中，R,NAi系统获得了不同程度的改进，包括进化出“内置式的”分子“刻度尺”，用来控制小RNA的大小和结构，从而挑选出小dsRNA中最合适的那条单链分子进入下一步骤；或,进化出防止“脱靶”现象出现的机制等等。 科研人员还发现RNAi通路的活性会在各个水平（从小RNA的生成到RISC复合物的沉默模式）受到严密调控。 各种不同的,RNA沉默途径之间存在竞争关系，比如黑腹果蝇中的endo-siRNA和miRNA之间就相互竞争LOQS。这种竞争机制就是RNAi途径中决定每一个阶段里如何发生调,控的关键步骤。很多植物和动物病毒都会编码抑制蛋白来抑制宿主细胞的RNAi途径，使得这些调控机制无法在各个不同
6、阶段发挥正常作用。细胞的蛋白质同样也能够调控RNAi,。比如，在人体胚胎细胞中，miRNAlet-7分子（一种抑癌分子，同时也是一种细胞周期调控分子）的生成过程就是一条转录后被抑制的过程，该途径被多潜能因子LIN2,8所抑制。LIN28蛋白可以阻止pri-let-7分子在微处理器复合物中的剪切过程及后续由Dicer蛋白负责的pre-let-7前体分子的处理过程。不过，人体同,时存在另一条路径。转化生长因子（TGF-）和生长因子家族中的骨形成蛋白（BMP）都能促进miR-21这种促癌分子的生成。这是因为这些蛋白能够促进DROSHA,将pri-miR-21转化成pre-miR-21。更确切地说，S
7、MAD蛋白家族成员TGF-和BMP信号转换因子与RNA解旋酶p68组成的复合物一起被招募至pr,i-miR-21，促进pre-miRNA形成。另外，不均一核糖核酸RNPA1蛋白（heterogeneousnuclearRNPA1，hnRNPA1）这种著名的,前体mRNA分子剪切调控因子也会帮助DROSHA发挥作用，有效地生成pre-miR-18，这可能是由hnRNPA1蛋白能够重新折叠发夹结构，或者直接与pri-m,iRNA结合，为DROSHA构建出一个酶切位点而造成的。这也说明在pri-miRNA分子中，某些发夹结构可能是在pri-miRNA分子与RNA伴侣蛋白结合之后才,会形成并被剪切的。
8、 RISC复合体的活性同样能够被调控。在拟南芥中，非编码基因IPS1中含有的一段基序能够与miR-399序列互补，但是它们之间的互补配对过程,却被该miRNA分子中酶切位点处的一段错配形成的环状结构给破坏了。这样，IPS1基因的mRNA产物不仅没能被miR-399降解，反而还大量“扣押了”miR-39,9分子。因此，如果IPS1基因大量表达会使得胞内“积聚”大量miR-399分子的靶标-PHO2基因mRNA。这种靶标之间的相似性会给RNA调控网络带来不可预料,的复杂性。我们预测，最近在人体细胞中发现的大量mRNA样非编码RNA分子（mRNA-likenon-codingRNA）可能会在小RNA
9、-Argonaute蛋白,复合体调控过程中起到“减速器（attenuator）”的作用。 RNAi机制中最引人注目的亮点就是仅由2030nt组成的小dsRNA。它们是由RNaseII,I酶（可以是Dicer单独发挥作用，也可以是Drosha和Dicer共同发挥作用）剪切长RNA得到的产物。按照小RNA的来源前体的不同，我们可以将其分为两大类：,一是小干扰RNA（siRNA），它是细胞为了应对病毒感染或者其它人工导入分子而剪切外源性长dsRNA前体而生成；二是miRNA，它由细胞运用其自身基因组编码的茎,环结构加工而来。借助高通量测序技术，人们发现了好几种内源性小RNA，包括最近发现的PIWI相
10、互作用RNA（PIWI-interactingRNA,piRNA）和,内源性siRNA（esiRNA）。 不过，这些小RNA子都有一个共同的特征，那就是它们都能与Argonaute蛋白相结合，从而发挥它们的靶向作用。 简述,小RNA分子的形成过程以及RNA沉默的机制 a、能够形成dsRNA结构或者发夹结构的天然转录产物是形成小RNA分子的前体物质。这些双链结构的RNA分子经由Dr,osha或Dicer等RNaseIII处理之后就能得到小dsRNA分子。如果这些小dsRNA分子之间的配对情况非常好，如图中左侧所示，那么就会经由Argonau,te蛋白的酶切活性进行进一步处理，生成小ssRNA产物
11、。如果像图中右侧所示的那样，小dsRNA分子之间的配对情况不是非常好，比如出现了错配或者有环状凸出，那么它,们就不能被Argonaute蛋白酶切处理，只能经由一种不依赖酶切活性的方式生成最终的小ssRNA产物。目前，我们对于究竟是哪种蛋白参与其中来发挥解链活性还不得而,知。生成的小ssRNA分子随后会与Argonaute蛋白结合，但究竟是哪一条单链分子（正链或负链）结合到Argonaute蛋白上则取决于它们的热力学稳定性。结合,了单链小RNA分子的Argonaute蛋白会根据单链RNA分子的序列寻找能够与其互补配对的mRNA分子，并与之结合，然后抑制它的表达。而究竟采用哪种机制沉默该基,因的表
12、达，比如是直接降解目的mRNA还是仅仅抑制其表达，在很大程度上取决于mRNA和小RNA分子之间的互补程度。 b、在秀丽隐杆线虫和某些植物细胞中发现，某些,小RNA分子还可以通过RNA依赖的RNA聚合酶（RdRP）来合成。有一些天然转录产物（通常它们都是异常的转录产物）都是这种依赖RdRP途径合成的小RNA分子的前,体来源物质。因此，缺乏RdRP活性的物种，比如哺乳动物和黑腹果蝇等物种体内是不会发现这种小RNA合成机制的。经过这种途径生成的小RNA分子随后同样也是与Argo,naute蛋白相结合，发挥抑制靶基因表达的作用。 c、有一类Argonaute蛋白只存在于生殖细胞当中，它们被称作PIWI
13、亚科蛋白，它们可以与piRNA结合，,随后形成的复合物能够沉默转座子。单链前体RNA分子在未知蛋白的作用下经过初步处理过程形成piRNA。在生殖细胞内，PIWI蛋白在沉默转座子的同时还能大量扩增pi,RNA分子，这个过程被称作进一步处理过程，或者叫ping-pong扩增环路反应，这种反应在包括小鼠和斑马鱼在内的多个物种体内都广泛存在，非常保守。在这步反应当中,，PIWI蛋白的剪切活性会不断剪切转座子转录产物（即piRNA的前体物质）形成piRNA的5端，但是piRNA的3端是由什么蛋白质负责生成的，我们现在还不清楚。,siRNA作为一种新兴的治疗技术，却已经以一种前所未有的速度迈进了临床试验阶
14、段。下面，我们将介绍几种已经进入临床试验阶段的人体疾病RNAi疗法。 第一个被,siRNA治疗指南批准获得临床研究新药（investigationalnewdrug，IND）资格，并且进入了临床试验的就是Bevasiranib，它是美国Ac,uity制药公司生产的针对血管内皮细胞生长因子（VEGF）的siRNA类药物。该药主要用于治疗渗出性老年性黄斑变性。所谓渗出性老年性黄斑变性，主要是因为视网膜后,血管大量生长，导致患者出现严重的不可逆性视力损伤。在小鼠试验中对Bevasiranib进行的临床前研究表明，直接眼部注射该药能够下调Vegf基因的表达，有效减少,新生血管数量。 还有两家公司也专注
15、于用siRNA治疗黄斑变性疾病，他们分别是美国的MercksSirnaTherapeutics公司（主要产品是针对VEGF,受体VEGFR1蛋白的Sirna-027）和Quark制药公司。他们和伦敦及柏林的SilenceTherapeutics公司（即以前的SR制药公司）合作，主要生,产靶定RTP801基因（又名DDIT4基因，该基因与黄斑变性疾病的进展有关）这种缺氧诱导基因的siRNA产品RTP801i-14。RTP801i-14已经被授权,给英国的Prizer制药公司，进行I/IIA期临床试验。Quark制药公司也已经获得了IND资格可以进行另一项临床前试验，他们目前正在为这项实验招募志愿
16、者。这项,实验的药物靶定TP53基因的siRNA。该药通过抑制p53蛋白的表达能够阻碍细胞凋亡通路，从而有望避免手术后出现的急性肾衰竭。 与此同时，美国的Calando,制药公司也开始了新药的临床试验项目。他们实验的新药是用于治疗实体瘤的靶定核糖核苷酸还原酶RRM2（该酶参与DNA的合成）亚基的siRNA。值得一提的是，这是第一,项使用受体介导递送方式的siRNA临床试验，该产品被连接有转铁蛋白的环糊精颗粒包裹。这样，药物就只会被细胞表面表达有转铁蛋白受体的细胞摄取，而转铁蛋白受体在肿瘤,细胞表面表达量就非常高。 Acuity制药公司与Merck公司旗下的SirnaTherapeutics公司合作进行的临床药物试验成功地稳定了患者的病情，阻止了,病情进一步加重，明显改善了患者的视力，而且还没有副作用和不良反应。这些成果让我们对玻璃体内注射siRNA这种治疗方法充满了信心。但是，Kleinman等人的报道,给我们当头泼了一盆冷水。Kleinman等
