《《园艺的实验手册》doc版》由会员分享，可在线阅读，更多相关《《园艺的实验手册》doc版（59页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、实验手册华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室细胞工程分室柑桔课题组二OO二年七月武汉目 录前 言1组 织 培 养21、培养基母液的配制32、柑桔胚性愈伤组织的诱导53、柑桔原生质体操作64、柑桔胚性愈伤组织和茎尖的超低温保存115、微嫁接136、花粉的制备和保存13分子生物学141、DNA提取和检测152、Southern blotting193、Northern blotting274、AFLP 标记305、SSR操作步骤366、ISSR操作步骤377、根癌农杆菌介导柑橘愈伤组织遗传转化388、PCR 产物的TA克隆419、植物RNA的分离和纯化（异硫氰酸胍法）4710、GISH分析49仪
2、 器 使 用511、色彩色差计CR-300的使用流程及注意事项522、细胞流式仪（PA）操作规程555757前 言We come here for the common interest. Every year we put our heart into the research so as to find something. But for a beginner it is of great difficulty for him to initiate the first step. Much time should be spent on the protocol reading, do
3、cument retrieval and method optimization. In order to, to some degree if not completely, avoid this tedious, time-consuming and baffling period the students in the Citrus Research Group of Cell Engineering Division of National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, Huazhong Agricultural Univers
4、ity, come up with the idea of summarizing their research protocols and ideas, which is what you will see now. I think this will be of great help for those who want to do the similar work shown herein. Though you can see the protocols in other references you cannot get every detail for the experiment
5、 because the introduction there is very sketchy. On the contrary you can see the details from the students personal generalization in this manual. The present manual covers many horizons of biological sciences, ranging from tissue culture to molecular markers that are state-of-the-art topics for the
6、 time being. In addition some introduction of machine operations are included so that those who want to use the instrument can benefit from this manual. Thanks should be extended to Prof. Xiuxin Deng for his kind offer of the financial support for the smooth publication of this manual. In the meanti
7、me gratitude should be given to all of the postgraduate students who have been working, are working here. Without their hard work we would not have been able to get a very through summary of the work.第一部分组 织 培 养1、培养基母液的配制一.大量元素(10倍液)：称取下列药品分别溶解定容到1升后，加到5升存储瓶中。KNO3 95gNH4NO3 82.5gKH2PO4 8.5g MgSO47H2
8、O 18.5gCaCl22H2O 22.0g注意事项：1配置母液前要仔细清洗存储容器2.应按照顺序分别彻底溶解后混合，每加完一种药品，摇动存储瓶使其混合均匀；3.溶解时最好加热，以便充分溶解，避免沉淀的产生；4.夏季要用新制的蒸馏水，并加热，这样可以避免因为水中带菌量过大而产生沉淀，同时可以减缓绿藻的生成；5.沉淀的产生一是由于溶解不充分就混合造成的（浑浊型沉淀），所以配置时一定不要急； 二是由于长菌而产生絮状沉淀，所以要用新制的蒸馏水并加热。二.微量元素母液的配制(100倍)：取少量(200-300ml)温水依次加入下列药品，每加一种药品后搅拌溶解，最后定容到1L：KI 0.083gH3BO
9、3 0.62g ZnSO4*7H2O 0.86gNaMoO4*2H2O 0.025gCuSO4*5H2O 0.0025gCoCl2*6H2O 0.0025gMnSO4*4H2O 2.23g (MnSO4*H2O 1.69g)注意： 配好后在室温下放置10 h以上再放入冰箱保存，即刻放入冰箱易产生结晶沉淀。配制过程中产生沉淀的原因有：1. 前一个没彻底溶解就加入了后一个药品；2. 蒸馏水pH 值过高，可加几滴盐酸校正。三.甘氨酸和肌醇的配制(100倍):甘氨酸: 0.2g溶解定容到一升; 肌醇: 10g溶解定容到一升。四.铁盐的配制（100倍）:称取EDTA 3.73 g , FeSO47H2O
10、 2.78 g , 分别溶解后混合定容到1L,放入棕色细口瓶中,室温放置10 h以上（防止结晶沉淀），然后放入4冰箱。五.维生素B的配制（100倍）：改良MT ： VB1（盐酸硫氨素）1g, MS： 10mgVB6 (盐酸吡哆素) 1g , 50mgVB5 (烟 酸) 0.5g, 50mg分别称取顺序溶解在温热的蒸馏水中，定容到1升。注: 需要溶解完一个再加另一个。VB5不易溶解,需要搅拌,必要时可以加热。六.Vc的配制：称取Vc 0.5g 溶解在蒸馏水中，定容到1升即可。七.其它BA, NAA, IBA, GA3等激素类试剂可先用少量1N NaOH 彻底溶解, 再加水定容。配好后在室温放置一
11、段时间，再放入冰箱中冷藏保存。有些试剂在乙醇或盐酸中也可溶解，但比较而言，用碱溶解比较稳定，不易产生沉淀。注意：母液最好不要配制太多，如果配制的量较大，短时间内用不完，最好分装一部分到小的细口瓶中，在做培养基时使用。这样不容易产生沉淀。2、柑桔胚性愈伤组织的诱导1 幼嫩胚珠诱导愈伤组织培养基（1）MT+ME（500mg/L)（2）MT+BA10mg/L（3）MT+IAA(0.1mg/L)+KT(0.5mg/L)2成熟果实未发育胚珠诱导愈伤组织培养基（1）GA3（1mg/L）+SAD(40mg/L)+MT(2) 2,4-D（0.01mg/L）+BA(0.1mg/L)+MT附成熟果实未发育胚珠的灭
12、菌及培养方法：取成熟果实，将果实剖开，去掉果肉，可发现囊衣内紧靠中柱处有许多未发育的小胚珠，长约1.5-2.5mm。用小镊子将这些未发育胚珠轻轻挑下，放入一培养皿中，培养皿中预先放入一张滤纸，以预防小胚珠干燥失水，取无菌滤纸一张，漏斗一支，将滤纸放入漏斗中，而后将已取出的小胚珠放入其中，再将3%次氯酸钠倒入漏斗进行消毒，消毒15分钟后，用无菌水进行冲洗3-5次，每次10分钟，然后将滤纸及小胚珠取出接种于诱导培养基中，进行暗培养。1-2个月后即可看到有胚状体的形成，有的从胚状体上直接形成愈伤组织，有的胚状体继续发育形成小植株，部分胚状体会产生次生胚状体，将这些胚状体在MT+AgNO35mg/L培
13、养基上进行暗培养，有利于愈伤的形成。3、柑桔原生质体操作一、材料的准备1. 胚性悬浮系的建立： 从固体培养基上取继代20天左右生长旺盛的愈伤组织于MT +ME 0.5g /L+ 谷氨酰胺1.5 g/L +蔗糖 40g/L 的液体培养基中 （每瓶50 ml），100转振荡培养，每两周继代一次，3 代后用于分离原生质体。2.无菌苗的获得：柑桔种子无菌条件下播种于MT培养基上，20-30天后叶片充分展开后用于分离原生质体。二、原年质体的分离1. 悬浮系原生质体的分离： 用吸管吸取1g 左右的继代6-10 天的悬浮培养物于15x60 mm的培养皿中，吸干培养基，加入1.5 ml 0.7 EME 和1.
14、5 ml 酶混合液，轻轻摇匀，封口膜封口，置于摇床上（20-30转）或静置，28暗条件下酶解16-24小时。2. 叶肉原生质体的分离：1.5 ml 0.6 EME 加入一15x60 mm的培养皿中，在此培养皿用解剖刀将叶片切成0.05-0.1cm的细条，后加入1.5 ml 酶混合液，轻轻摇匀，封口膜封口，置于摇床上（20-30转）或静置，28暗条件下酶解16-24小时。三、 原生质体的纯化：1. 酶解后的原年质体经孔径为45 m 的不锈刚网去掉渣质,CPW13 洗涤以收集大量原生质体,滤液在10ml 离心管中离心（100转）10分钟，使原生质体沉于管底。2. 沉淀物用3ml CPW25 悬浮，
15、在其上轻轻加入1ml CPW13 ，100转离心2-6 分钟，原生质体在两液面间形成一条带，其它杂质及少量原生质体沉于管底。（注：如果此种情况下无法形成界面，则原生质体沉淀物用CPW13 悬浮）3. 将原生质体轻轻吸出，置于另一离心管中，用电融合液离心洗涤6-8分钟，去掉上清液，用电融合液悬浮至5-10 x 105 个/ml 备用。（用血球计数板调密度，一个大方格中原生质体数x10000即是原生质体密度）四、原生质体活性检查FDA用丙酮配制成5 mg/ml 的浓度。按25 l FDA /ml 原生质体的比例加入FDA，5 分钟后在万能显微镜下检查原生质体活性（暗视野下发荧光原生质体数/明视野下原生质体总数）。注：叶肉原生质体发红色荧光，而悬浮原生质体发黄色荧光。五、原生质体融合一） PEG法1. 将悬浮好的双亲原生质体等体积混合2. 用吸管滴2 滴混合好的原生质体于15 x 60cm 塑料培养皿中央，立即
