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1、广东医学院2003级 硕士研究生开题报告,p16在宫颈癌发生中的作用及其机制的研究,研究生： 邓飞 导师： 胡新荣 教授 时间： 2004年10月22日,立题依据,肿瘤的发生是一个多因素、多步骤的长期过程，其中多个基因的改变导致细胞周期失调，细胞增殖失控在肿瘤形成的过程中发挥了重要作用。 p16基因又称MTS1（多肿瘤抑制基因）是人们发现的第一个直接作用于细胞周期，抑制细胞分裂的基因。 p16在诸多肿瘤中的改变，使它在肿瘤发生中的作用日益受到人们的重视。,一、p16的基因结构和功能,1、p16的基因结构,p16基因定位于9p21，全长8.5kb，由三个外显子和两个内含子构成，三个外显子的长度分
2、别为126、307、11bp，其cDNA全长450bp。p16基因启动子和外显子1、2含有多个可甲基化的5CpG岛。 p16基因编码产物p16蛋白，由148个氨基酸构成，为16kd,2、p16的功能,RB,E2F,RB,P,P,P,P,E2F,INK4A,p16,cyclinD1,CDK4/6,P,CDK,cyclinD1,CDK4/6,cyclinD1,CDK4/6,CDK4/6,P,竞争性抑制,二、p16与肿瘤,研究表明，p16基因的缺失、突变和甲基化存在于多种人肿瘤细胞，提示其与肿瘤的发生、发展有着密切的关系。,p16除了调节细胞周期，抑制细胞异常增殖以外，还与肿瘤细胞中端粒酶活性的调节
3、和肿瘤细胞的永生化有关。,大量的实验证据使人们相信在大多数肿瘤中p16扮演者抑癌基因的角色。,三、p16与宫颈癌,宫颈癌是妇女常见肿瘤之一，其发生机制尚不清楚。对于p16与宫颈癌关系的研究，已成为近几年来宫颈癌发生机制研究中的热点。,同在大多数肿瘤中一样。p16基因也被认为在宫颈癌发生中的扮演着抑癌基因的角色，其主要依据有 ： 1、宫颈肿瘤组织中，普遍都能检测到p16基因的失活。 2、p16基因及其编码蛋白在体外实验中能抑制宫颈癌细胞系的生长。,然而，在对p16的进一步研究中，人们用免疫组化检测临床病例标本的p16蛋白表达后发现，p16蛋白的表达会随着宫颈癌病情的进展而呈现逐渐升高的趋势 。,
4、这一发现使人们对p16在宫颈癌发生中的作用产生了疑问： （1）p16在宫颈癌发生过程中起什么作用，是否与在其他肿瘤中一样起着抑癌作用。 （2）如果p16是抑癌基因，为什么其失活率随宫颈癌的发生而逐渐增加的同时，表达也逐渐升高。,以上问题迄今为止，都还没有得到满意合理的解释，国内也缺乏此类相关研究。本实这些验即是针对以上问题展开初步的探讨。,实验目的,1、研究p16在宫颈癌的发生过程的表达趋势。 2、研究p16在宫颈癌发生中的作用及机制。,拟解决的关键问题,1、p16在宫颈癌发生过程中表达是否升高。 2、高表达的p16与cyclinD1竞争性结合CDK4/6的能力是否改变。 3、p16高表达与p
5、Rb磷酸化的关系。 4、体外实验中p16表达对cyclinD1与CDK4/6的结合能力及pRb的磷酸化水平的影响。,拟采取的研究方法,（1）IHC （2）CO-IP、IP、western-blot （3）siRNA转染宫颈癌细胞系,技术路线,一、临床实验,1、p16表达的检测：,临 床 病 例 标 本,切片、HE,同一组织来源,不同组织来源,癌前病变,宫颈癌,癌前病变,宫颈癌,p16,P16 的 表 达 趋 势,图像 分析,IHC,2、p16功能检测,p16高表达的宫颈癌标本,P16低表达的宫颈癌标本,提取组织块 中的蛋白质,p16-CDK4/6,pRb-P,对比不同组结果， 研究p16表达与
6、pRb 磷酸化的关系,对比不同组的 结果，研究p16 表达升高对其 功能的影响。,CO-IP、 western,IP western,二、体外实验,p16高表达的 宫颈癌细胞,筛选,p16表达缺失的 宫颈癌细胞,CyclinD1-CDK4/6 pRb-P,CyclinD1-CDK4/6 pRb-P,CO-IP、IP、western-blot,对比分析 得出结论,siRNA,腺病毒转染,预期结果,1、p16在宫颈癌的发生过程中表达逐渐升高。 2、临床实验中，p16高表达组比低表达组，p16与CDK4/6的结合增加，pRb的磷酸化水平升高。 3、体外实验中，转染前后，cyclinD1与CDK4/6的结合增加，pRb的磷酸化水平降低，,进度安排,2004.102005.7 临床病理标本的收集。细胞系的筛选，细胞转染及转染后筛选。 2005.82006.1 IHC、CO-IP、IP、western-blot。 2006.22006.4 结果分析，撰写论文，准备答辩。,经费预算,免疫组化 2000元 免疫沉淀 5000元 Western-blot 3000元 细胞培养 2000元 siRNA转染 25000元* 总计 37000元,请老师同学多提宝贵意见,
