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1、微生物限度检查方法验证方案编号 部门起草人 起草日期所在部门 签字 日期年 月 日年 月 日年 月 日年 月 日年 月 日年 月 日年 月 日年 月 日年 月 日年 月 日年 月 日审核人年 月 日方案的批准及实施日期:批准人: 年 月 日目 录1、 概述2、 验证目的3、 验证条件4、 验证步骤5 验证试验小结1.概述微生物限度为产品质量的一个重要指标，其检查方法的选择对检验结果真实性有很大的影响，为此必须对其检查方法进行验证。2.验证目的通过对微生物限度检查方法的验证，确认在正常条件下本检验方法处于控制状态，且能够稳定地对公司产品进行有效的微生物的检查和控制。确认相应标准操作规程的适用性。
2、3. 验证条件3.1 验证小组成员与分工3.2 参加本方案实施操作的人员须事先进行微生物限度检查标准操作程序的培训，能熟练掌握检查方法和原理，熟悉本方案的内容。3.3 验证所用的各类物料均应符合相应的规定或标准。相应的设备须验证的应事先进行验证并符合要求。4.验证步骤41 验证依据参照 2010 年版中国药典微生物限度检查计数方法的验证42 与验证有关的文件微生物限度检查标准操作程序文件编号：SOP-ZL-010净化工作台标准操作程序文件编号：SOP-ZL-032 43 验证用材料成员姓名 所在部门 分工生产部 负责组织协调和安排实际生产。生产车间 按照要求组织生产。质量部负责起草验证方案，负
3、责对产品质量的现场监控，现场指导实施和对验证结果进行汇总、分析、总结以及完成验证报告检验室 负责安排检验工作431 试验样品 药品包装用复合膜产品432 实验菌株 1金黄色葡萄球菌 CMCC（B ）260032大肠埃希菌 CMCC（ B）441023枯草芽孢杆菌 CMCC（B ）635014白色念株菌CMCC（ F）980015黑曲霉CMCC（F ）98003以上菌株购自省药品检验所。44 细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证441 验证方法4411 菌液制备 接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物至营养肉汤中，培养 1824 小时；接种白色念株菌至改良培养基中，培养 2448 小
4、时，上述培养物用 0.9%无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含菌数为 50100CFU 的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养 57 天，加入 35ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，然后，吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内，用 0.9%无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含孢子数为 50100CFU 的孢子悬液，备用。4412 供试液制备 取药品包装用复合膜用开孔面积为 20cm2消毒过的金属模板压在内层面上，将无菌棉签用 0.9%无菌氯化钠溶液稍沾湿，在板孔范围内擦抹 5 次，换一支棉签再擦抹 5 次，每个位置用 2 支棉签共擦抹
5、 10 次，共擦抹 5 个位置 100cm2。每支棉签抹完后立即剪断（或烧断） ，投入盛有 30mL0.9%无菌氯化钠溶液的锥形瓶（或大试管）中。全部擦抹棉签投入瓶中后，将瓶迅速摇晃 1 分钟，即得供试液。4413 试验组供试液的制备 取 1：10 的供试液 3ml 和 50100CFU 的试验菌液，注入营养琼脂培养基，平行制备 2 个平皿，置适宜温度培养 2472 小时，观察结果。按中国药典 2010 年版微生物限度菌落计数方法测定菌数。4414 菌液组供试品的制备 取菌液 1ml 分别注入平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，平行制备 2 个皿，置适宜温度培养 2472 小时，观察结果。按中国药
6、典 2010 年版微生物限度菌落计数方法测定菌数。4415 供试品对照组供试品的制备 取供试液 1ml，立即倾注营养琼脂培养基，平行制备 2 个皿，置适宜温度培养 2472 小时，观察结果。按中国药典 2010 年版微生物限度菌落计数方法测定本品的本底数。4416 菌落数回收率计算试验组平均数供试品对照组平均数试验组的菌回收率（%）= - 100%菌液组的平均菌落数4417 回收率测定结果见附件一。45 控制菌检查验证451 大肠埃希菌检查的验证方法4511 菌液制备 接种大肠埃希菌至营养肉汤培养基中，培养 1824 小时，培养物用 0.9%无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含菌数为 10100C
7、FU 的菌悬液。4512 试验组：取上述供试液 10ml 和 10100CFU 的大肠埃希菌加入胆盐乳糖培养基中，培养 24 小时。4513 阴性菌对照组：将金黄色葡萄球菌 10100CFU 加入胆盐乳糖培养基中，培养24 小时。取上述培养物 0.2ml，接种至含 5mlMUG 培养基中培养，于 5 小时、24 小时在366nm 紫外光线下观察，同时用未接种的 MUG 培养基作本底对照。若管内培养物呈现荧光，为 MUG 阳性；不呈现荧光，为 MUG 阴性。观察后沿培养基的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。4514 控制菌验证试验测定结果见附件二。附
8、件二： 控制菌（大肠埃希菌）验证测定内 容 增 菌 组 M U G 靛 基 质试验组阴性菌对照组附件一： 菌回收率测定结果表菌 落 计 数 回 收 率菌 种试 验次 数供试品稀释倍数 试 验 组 菌 液 组供 试 品对 照 组试 验 组1 1：102 1：10大肠埃希菌3 1：101 1：102 1：10金黄色葡萄球菌 3 1：101 1：102 1：10枯草芽孢杆菌 3 1：101 1：102 1：10白色念株菌3 1：101 1：102 1：10黑曲霉 3 1：105验证试验小结本品经采用平皿法处理后，对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念株菌、黑曲霉生长无影响，其试验组回收率达 70%以上，符合中国药典 2010 年版二部微生物限度验证试验要求。细菌、霉菌及酵母菌计数方法可采用平皿法。本品按常规法对控制菌大肠埃希菌进行了验证试验，结果符合中国药典 2010 年版二部微生物限度验证试验要求。故控制菌检查可采用常规法检查大肠埃希菌。
