LC-MS基本知识及应用

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1、基础知识 优点： 1. 灵敏度高， 10-7 10-8g,单离子检测可达 10-12g 2. 快速，几分甚至几秒 3. 测定分子量，确定分子式 4. 分析范围广，便于混合物分析 5. 新的电离、检测技术 局限性 : (1)异构体，立体化学方面区分能力差。 (2)重复性稍差，要严格控制操作条件 (3)有离子源产生的记忆效应，污染等问题。 (4)价格稍显昂贵，操作有点复杂 (5)质量歧视效应 离子源 1.电感耦合等离子体离子化（ icp） 由于该条件下化合物分子结构已经被破坏，所以仅适用于元素分析。 2.电子轰击电离（ ei） 能提供有机化合物最丰富的结构信息，有较好的重现性 ，其裂解规律的研究也

2、最为完善。 缺 点在于不适用于难挥发和热稳定性差的样品。 3.化学电离（ ci） 适合于色谱和质谱联用 ,低气压化学电离源可以在较低的温度下分析难挥发的样品，并能 使用难挥发的反应试剂，但是只能用于傅里叶变换质谱仪。 4.大气压电离源（ api） 液质联用仪最常用的离子化方式。 常见的大气压电离源有三种：大气压电喷雾（ ESI），大气压化学电离（ APCI）和大气 压光致电离（ APPI）。 由于大气压电离源是独立于高真空状态的质量分析器之外的，故不同大气压电离源之间 的切换非常方便。 5.基质辅助激光解吸离子化（ maldi） 主要用于可达 100000da质量的大分子分析，仅限于作为飞行时

3、间分析器和 FT-MS的离子源使用。 特别适合蛋白质，多肽等大分子，可以直接从组织样品采集数据。 电喷雾 VS大气压化学电离 电离机理： 电喷雾采用离子蒸发，而 APCI电离是高压放电发生了质子转移而生成M H+或 M-H-离子。 样品流速： APCI源可从 0.2到 2 ml min；而电喷雾源允许流量相对较小 ,一般为0.2-1 ml min. 断裂程度： APCI源的探头处于高温，热不稳定的化合物会分解 . 适用范围： 电喷雾有利于分析极性大的小分子和生物大分子及其它分子量大的化合物，而 APCI更适合于分析极性较小的化合物。 多电荷： APCI源不能生成一系列多电荷离子 TMP 1 T

4、MP 2 旋转泵 废 液管 Detector 四极杆 前杆 入口镜 聚焦镜 八极 Q-array 分液器 隔离板 From LC Nebulizer Gas ESI/APCI CDL Drying gas LCMS 质量分析器 1.四极杆质量分析器 2.飞行时间质量分析器 3.离子阱质量分析器 4.傅里叶变换质量分析器四极杆质量分析器 5.扇形磁分析器 多级质量分析 通常通过由惰性气体分子，例如氮气，氩气或氦气，碰撞所选择的分子离子来实现的。这种通过中性分子的碰撞把能量传递给离子的过程就是所谓的 “ 碰撞诱导解离（ CID） ” 。这种能量传递足以使分子键断裂和所选择的离子重排 碎片离子被用于

5、对原来的分子离子的结构判断。 为什么使用 HPLC/MS/MS? 不需进行衍生化。 在单个分析中实现确认 /定量。 在复杂 /很脏的基体中的低检测限 第一类仪器利用质谱在空间中的顺序，是由两台质谱仪串联组装而成。即前面列出的串列式多级质谱仪。 第二类利用了一个质谱仪时间顺序上的离子储存能力，由具有存储离子的分析器组成，如离子回旋共振仪（ ICR）和离子阱质谱仪。但不能进行母离子扫描或中性丢失。 MS/MS 串联四极杆质谱 比单四极杆质谱的抗基质干扰能力和定性能力更好，与离子阱质谱相比定量重现性和检测灵敏度更好 质量范围及分辨率有限 四极离子阱 技术上而言，在传统 QqQ的四极杆中加入了辅助射频

6、，可以做选择性激发；或者就功能而言，为 QqQ提供了多级串级的功能 四极杆 -飞行时间质谱 QMS作为质量过滤器，以 TOFMS作为质量分析器。 离子阱 -飞行时间质谱 以 3D离子阱作为质量选择器和反应器，结合了离子阱的多级质谱能力和飞行时间质谱的高分辨能力 线性离子阱 -飞行时间质谱 以线性离子阱为质量选择器和反应器，结合了线性离子阱的高灵敏度多级串级能力和飞行时间质谱的高分辨能力 串联四极杆线性离子肼质谱仪 LTQ-FT液质联用串联质谱仪 Thermo Finnigan生产 LTQ-FT液质联用串联质谱仪，实现了最先进的离子阱技术与傅里叶变换离子回旋加速器共振技术的完美结合，大大提高了分

7、析的多样性。利用该联用技术得到的分析数据具有超高分辨率、精确质量数和多级质谱分析等特点。 质量分析器的性能特点 四极杆 离子阱 飞行时间 磁扇形 FTMS 四极杆飞行时间 准确率 0.01 (100ppm) 0.01 (100ppm) 0.02到0.2% (200ppm) 300,000 10,000 10,000 10,000 扫描速度 秒 秒 千分之 一秒 秒 秒 秒 多级质谱 质谱 2 (三极杆 ) 质谱n 质谱 质谱 2 质谱 n 质谱2 多级质谱的评价 高准确率 高分辨率 低能量碰撞 高准确率 高分辨率 低能量碰撞 不能广泛应用 有限的分辨率 高能量碰撞 子离子具有极高的准确率和分辨

8、率 极高的准确率和分辨率 低能量碰撞 高灵敏度 QqQ 第一个四极杆 (Q1)根据设定的质荷比范围扫描和选择所需的离子。 第二个四极杆 (q2) ，也称碰撞池，用于聚集和传送离子。在所选择离子的飞行途中，引入碰撞气体，例如氮气等。 第三个四极杆 (Q3)用于分析在碰撞池中产生的碎片离子。 Q1选择了某一特定质量的母离子， Q2碰撞池产生碎片离子，然后在 Q3中分析。此过程产生典型的质谱/质谱碎片谱图。 具体应用 正离子模式：适合于碱性样品，可用乙酸或甲酸对样品加以酸化。样品中含有仲氨或叔氨时可优先考虑使用正离子模式。 负离子模式：适合于酸性样品，可用氨水或三乙胺对样品进行碱化。样品中含有较多的

9、强伏电性基团，如含氯、含溴和多个羟基时可尝试使用负离子模式。 离子峰的主要类型 一、分子离子峰 二、同位素离子峰 三、 碎片离子峰 一 分子离子峰 分子离子就是有机分子受到电子轰击后失去一个电子而形成的带正电荷的离子，以 M+.表示， 纯样品的质谱中分子离子峰应具备下列条件： （ 1）在质谱图中必须是最高质量的离子； （ 2）必须是一个奇电子离子； （ 3）在高质量区，它能合理地丢失中性碎片 (小分子或自由基）而产生重要的碎片离子。 除了同位素离子峰和准分子离子，如质子化的分子离子（ M+1)+、钠化的分子离子（ M+23)+和缔结的分子离子（ M+R)+，分子离子必然出现在质谱图中的最高质量

10、处。 C8H18O化合物 C8H18O的分子量： 130 分子离子峰 氮规则 当化合物不含氮或含偶数个氮原子时，该化合物分子量为偶数；当化合物含奇数个氮原子时，该化合物分子量为奇数。 例如： CH4 M=16 12C+1H 4=16 M 13C+1H 4=17 M+1 12C+2H+1H 3=17 M+1 13C+2H+1H 3=18 M+2 同位素峰 分子离子峰 二 同位素离子峰（ M+1峰） 由于同位素的存在，可以看到比分子离子峰大一个质量单位的峰；有时还可以观察到 M+2， M+3。； 1 61 5m / z R A1 3 . 11 2 1 . 01 3 3 . 91 4 9 . 21

11、5 8 51 6 1 0 01 7 1 . 1m / z同位素的相对丰度（强度） 三 、 碎片离子峰 当有机化合物蒸气分子进入离子源受到电子轰击时，裂解生成质荷比较小的碎片离子。 H3C C H2C H2C H2C H2C H31 57 12 95 74 34 35 72 97 11 5H3C C H2C H2C H2C H2C H3H3C C H2C H2C H2C H2C H3H3C C H2C H2C H2C H2C H3H3C C H2C H2C H2C H2C H3C H3C H2C H2C H2C H2C H31 52 94 35 77 1正己烷 第一步：电荷或自由基的定位 首先被

12、轰击掉一个电子发生电离的是分子中处于杂原子最高能级的 n电子，其电子在各轨道易被电离的顺序为： 分子离子中的电荷总是优先定位在分子杂原子（如氧、氮）或双键等官能团上 ，如： ABCD + e - ABCD+ + 2e - 分子离子 第二步：化学键的断裂 三种方式： 断裂、 断裂和重排断裂 BCD + A + B + A + CD + AB + A + B + ABCD+ D + C + AB + CD + C + D + 碎 片 离 子 1、 断裂 A B BA +H3C C H2C H2C H2C H2C H31 57 12 95 74 34 35 72 97 11 5H3C C H2C H

13、2C H2C H2C H3H3C C H2C H2C H2C H2C H3H3C C H2C H2C H2C H2C H3H3C C H2C H2C H2C H2C H3C H3C H2C H2C H2C H2C H31 52 94 35 77 1正己烷 2、 断裂 B A Z A Z + BR C H2O H RC H2O H +R C H2O RRC H2O R+R C H2N R2 RC H 2 N R2+R C H2S RRC H2S R+N H2+N H23 03 0m / z6 0 1 0 0 1 3 0M o l . W t . : 1 3 1 . 2 6 M o l . W t

14、 . : 7 1 . 1 4 M o l . W t . : 3 0 . 0 57 11 3 1最大烷基丢失规律 分子离子或其他离子以同一种裂解方式进行时，总是失去较大基团的裂解过程占优势，形成的产物离子丰度较大。 2-已酮在进行 a-裂解时，丢失丁基自由基产生 100%的 CH3CO+，而丢失甲基产生 C4H9CO+的丰度只有 2%。 常见低质荷比碎片离子 3、重排断裂 麦氏重排（ Mclafferty rearrangement) 麦氏重排条件： 含有 C=O， C=N， C=S及碳碳双键 与双键相连的链上有 碳，并在 碳有 H原子（ 氢） 六圆环过度， H 转移到杂原子上，同时 键发生断裂，生成一个中性分子和一个自由基阳离子 C HC HC HCZHR 1R 2R 3R 4C HC HR 3R 4H CCZ HR 1R 2011杂质 -LCMS谱图 杂质的可能结构式 NNNNONNNOHC 2 0 H 1 9 N 7 O 2M o l . W t . : 3 8 9 . 4 1NNNOH 2 NC 1 3 H 1 0 N 4 OM o l . W t . : 2 3 8 . 2 4