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1、1基于代谢组学整体表征的黄药子肝毒性研究作者：崔立然，于栋华，徐浩，刘树民【摘要】 目的研究经黄药子染毒后大鼠尿液的代谢表型的改变及其与血浆生化指标的相关性，探讨代谢组学在中药黄药子肝毒性研究中的可行性。方法运用 UPLC-Q-TOF/MS 技术手段对空白组、黄药子组的大鼠 7 d 的尿液进行分析，建立各组大鼠的尿液代谢轮廓图，并进一步借助模式识别方法主成分分析，从体内微观角度表征各组大鼠代谢网络的异同，来探讨代谢组学在中药黄药子毒性研究中的可行性。结果初步确定空白和黄药子组大鼠尿液代谢轮廓图的差异，在主成分得分图中给药后大鼠尿液代谢物组发生变化且被明显分为两类，给予黄药子后大鼠尿液中的代谢物
2、在主成分得分图上的落点离散分类，且黄药子组的代谢产物谱变化与血液生化改变相一致，表明代谢组学可用于中药黄药子肝毒性研究。结论从代谢物组的角度可以诠释传统中药黄药子肝毒性，为传统中药毒性研究从机体整体的观点提供了新的思路、方法和技术手段。 【关键词】 黄药子; 肝毒性; 代谢组学黄药子为薯蓣科薯蓣属植物黄独 Dioscorea bulbifera L.的块茎，药性苦寒，具有散结消瘿、清热解毒、凉血止血的作用，其有广泛的药理活性，可用于瘿疾瘤肿等，但其也为肝固有毒物，其毒性严重制约了其在临床上的卓越疗效的发挥。本实验利用能够反映机体真实状态、代表机体整体机能，具有与中医治疗疾病的整体观、辨证观相一
3、致的特点的代谢组学的研究方法1，2，通过研究外源性物质(药物)对机体所形成的生化物质的总体代谢调控作用，探讨代谢组学在中药黄药子毒性研究的可行性，为传统中药毒性研究从机体整体的观点提供了新的思路、方法和技术手段。1 仪器与材料1.1 仪器 Agilent 1200 RRLC 液相色谱仪(美国);安捷伦 6510 Q-TOF 质谱仪(美国);KDC-160HR 高速冷冻离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司);KQ-50B超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);MiLLiPORE 纯水机(美国密理博公司);微量移液器，SOCOREX(瑞士);GLYZ-0.5B 型冷冻干燥机(上海);日立 702
4、0 型全自动生化分析仪(日立公司，日本)。1.2 药品与试剂黄药子购于黑龙江省药材公司，产地河北，经黑龙江省药检所鉴定，为薯蓣科植物黄独 Dioscorea bulbifera L. 的块茎。乙腈为色谱级，美国天地公司;娃哈哈纯净水，再经本室 Milli-Q 纯水机制备;甲酸色谱级，美国霍尼韦尔公司;丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒、胆红素(TBIL、DBIL)试剂盒、血清总胆汁酸(TBA)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所 (南京，中国)。1.3 动物 Wistar 大鼠，雄性，清洁级，体质量(20020)g(北京维通利华实验动物技术有限公司提供)，动物合格证号：SCXK(京 2007-00
5、01)。大鼠于室2内保持 12h 光照，12h 避光循环饲养，给予标准饲料和饮用水，且控制室内温度为(221)、相对湿度在 40%左右。2 方法2.1 样品的采集与制备雄性 Wistar 大鼠 10 只，随机分为空白对照组、黄药子组。放入代谢笼(苏州市冯氏实验动物设备有限公司生产)中适应环境后，黄药子组(50 g/kg 临床常用剂量的 25 倍量)，空白组给予同体积生理盐水，连续给药 7 d。每天用代谢笼收集大鼠 24 h 尿液，连续取样 7 d，每天早晨 8 h 收集 1次，尿液置于冰中保存。尿液样品于 4 13 000 r/min 离心 10 min，取上清液过 0.22 m 微孔滤膜，于
6、低温冰箱中供 UPLC-Q-TOF/MS 分析。实验结束后处死动物采集血浆。2.2 色谱条件色谱柱为 Agielnt zorbax Eclipse C18column (100 mm4.6 mm 1.8 m，Agilent，USA);流速 0.40ml/min;柱温 35;流动相 A：0.1%甲酸-水溶液;流动相 B:0.1%甲酸-乙腈溶液;进样体积 5 l;梯度洗脱程序(见表 1)。二极管阵列检测器全波长扫描，紫外检测器流出液不经分流直接导入质谱系统检测。表 1 色谱梯度洗脱程序时间 t/minA2.3 质谱条件电喷雾离子源 ESI(+);毛细管电压正离子扫描为 3 800 V;脱溶剂温度为
7、 350;脱溶剂气流量正离子扫描为 8 L/min;锥孔气流量为 100 L/h;碰撞能为 3 V，碰撞气为氮气;碰撞室压力 40 psi;准确质量校正采用亮氨酸-脑啡肽(leucine-enkephalin，M+H+556.277 1;M-H-=554.261 5)溶液;扫描方式为全扫描，质量扫描范围 m/z 1001 000;Ref mass：922.009798118.086255622.02896。2.4 数据处理2.4.1 统计学方法 应用 SPSS16.0 统计软件进行多因素方差分析，各组数据均用s 表示，采用 t 检验。2.4.2 数据处理采用 Genespring MS 软件进
8、行色谱峰识别以及峰匹配，并采用主成分分析法(PCA)对大鼠尿液的代谢组进行分析。3 结果3. 1 临床化学评价对大鼠血清 TBA、ALT、TBIL、DBIL 的影响见表 2。结果显示：灌胃给药 7 d 黄药子组 ALT 上升了 28.50%(P0.05)、TBA 上升了89.87%(P0.01)、DBIL 上升了 701.95%(P0.01)、TBIL 上升了1338.16%(P0.01)，表明黄药子具有一定的肝毒性。表 2 给药组 7d 对大鼠ALT、TBA、TBIL、DBIL 的影响3.2 黄药子大鼠肝损伤尿液代谢轮廓图分析比较空白组与黄药子组大鼠第 7天尿液的 UPLC Q-TOF/MS
9、 BPI 轮廓图(见图 12)，发现第 7 天口服给与黄药子溶液后，给药组大鼠尿液代谢轮廓发生了明显的变化，说明疾病病理过程中代谢网络的某些环节出现紊乱,其低分子量代谢物组的质或量出现变化。图 1 空白组3大鼠尿液中代谢产物正离子模式 UPLC Q-TOF/MS BPI 轮廓图图 2 黄药子组大鼠尿液中代谢产物正离子模式 UPLC Q-TOF/MS BPI 轮廓图3.3 黄药子大鼠肝损伤尿液代谢的主成分分析本实验采用 PCA 的方法进行尿液的数据分析，PCA 分析结果的输出形式为 PC 图(又称 Scores 图)。本研究 PC轨迹图直接地对黄药子组和空白组大鼠不同天数的尿液的代谢指纹数据进行
10、分析，绘制出反映组间离散程度的 Scores plot(见图 3)。对图 3 进行分析可知口服给予黄药子后大鼠尿液代谢物组发生了明显的变化，空白组及黄药子组明显被分为两类。说明给予黄药子后大鼠正常生理代谢被干扰。4 讨论中药作用于人体时人体受到中药中多种外源物质的同时作用，从单一的化学成分得出中药多成分作用下的毒性虽然有一定的可取之处，但不符合中医药的整体效应的特点，在系统的代谢组学研究方法下中药以及中药新药的毒性早期筛查的中药(尤其是复方)的整体性作用机制和疗效将得到充分的展示和“挖掘” ， 能更好地指导临床用药。图 3 黄药子组大鼠尿液 scores plot 图(ESI+)黄药子组大鼠在
11、连续给药第 7 天的代谢轨迹图 1 与图 2 相比变化显著，图 3黄药子组与对照组在分值散点图中尿液中内源性代谢物呈分类趋势，明显聚为两类。通过 PC 时点轨迹的 PCA 对黄药子组大鼠尿液主成分分析后，可知与空白组比黄药子组小分子内源性代谢产物的种类、浓度、和相对比例产生显著变化，从这些变化的物质可初步推测动物机体的多个代谢途径对肝损伤做出了应答。本研究建立了尿液内源性小分子代谢物评价黄药子的肝损伤的评价体系并验证了代谢组学方法用于黄药子毒性评价的可行性。分析与肝内源性小分子代谢物的形成，转移机制和过程相关的小分子代谢产物如与肝脏损伤有关的牛磺酸、甘氨酸、乙酸、甘氨酸如机体内甘氨酸和牛磺酸结
12、合成胆汁酸(胆汁的主要成分)，肝脏胆汁酸浓度过高(胆汁淤积)可导致牛磺酸经肾脏排泄量增加，尿中牛磺酸和甘氨酸排出增加可作为肝脏损伤判断标准;氨基酸类水平(肝脏是各类氨基酸分解谢的主要场所);柠檬酸，2-酮戊二酸(2-OG)，琥珀酸，乳酸(三羧酸循环的原料及中间体，其中如 2-OG 减少，三羧酸循环减弱，线粒体功能降低);与能量代谢相关的葡萄糖;肝细胞胆汁淤积相关的特异胆汁酸的代谢产物 Glycocholate(甘氨酸胆盐)等等的变化并结合上述血清生化指标的改变，这些可能改变的代谢成分均有可能作为研究黄药子肝毒性的特异候选标志物。当然，任何药物的毒性机制不是单方面的，是一个错综复杂的过程，但利用代谢组学技术至少能在机体代谢方面给出很好的提示。【参考文献】1 Nicholson J K,Connelly J,Lindon J C,et al.Metabonomics:a platform for studying drug toxicity and genefunctionJ.Nat Rev Drug Discov,2002,1(2): 153.2 王喜军,孙文军,孙 晖,等.CCl4 诱导大鼠肝损伤模型的代谢组学及茵陈4蒿汤的干预作用研究J.世界科学技术-中医药现代化,2006,8(6):101.
