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1、1嗅鞘细胞移植后脊髓半横断大鼠睫状神经营养因子和FGF2 表达的变化作者：毕文杰 章为 王廷华 朱振东 王健 马玉琼 郑翔 周雪【摘要】 目的： 研究嗅鞘细胞（olfactory ensheathing cells, OECs）移植到损伤的脊髓后，能否分泌睫状神经营养因子（CNTF）和碱性成纤维细胞生长因子（FGF2 ） ，以及能否引起脊髓组织内 CNTF 和 FGF2 表达的变化及脊髓的细胞有何数量改变。方法： 体外分离培养大鼠嗅球嗅鞘细胞，通过免疫荧光细胞化学染色检测其 CNTF 和 FGF2 的表达。将嗅鞘细胞移植入脊髓半横断 SD大鼠，观察术后 7 天和 21 天嗅鞘细胞在脊髓内的存活
2、情况，并对脊髓组织切片进行 CNTF 和 FGF2 免疫荧光组织化学染色，计数阳性细胞并计算阳性面积百分比。结果： 嗅鞘细胞在体外培养和移植后都能表达 CNTF 和 FGF2 。同未移植组对比，移植组脊髓 CNTF 和 FGF2 表达明显增强（P0.05） ，神经元和少突胶质细胞数量增加(P0.05)，星型胶质细胞数量无明显改变。结论： 嗅鞘细胞移植入损伤的脊髓后能分泌 CNTF 和 FGF2 ，并使脊髓组织内 CNTF 和 FGF2 的表达增加，引起神经元和少突胶质细胞数量增加。 【关键词】 脊髓损伤； 嗅鞘细胞； 移植； 睫状神经营养因子（CNTF） ； 碱性成纤维细胞生长因子（FGF2
3、）Abstract Objective: To investigate whether olfactory ensheathing cells(OECs) could secret ciliary neurotrophic factor(CNTF) and basic fibroblastic growth factor(FGF2), and make expression change of them when planted in the spinal cord, then count the change of number for spinal cord cells. Methods：
4、 To culture and identify the rat OECs. We detected the expression of CNTF and FGF2 by immunofluorescence cytochemistry in OECs cells. OECs were transplanted into the hemisectioned spinal cord of adult SD rats and their survival condition was observed at 7th days and 21st days after transplantation.
5、The CNTF and FGF2 positive cell number and the positive area percentage, as well as the number of neuron and neuroglia calculated by immunofluorescence analysis in the spinal cord. Results： OECs could express CNTF and FGF2 in vitro and in viro post transplantation. Significantly higher levels of CNT
6、F and FGF2 expression were detected compared with control(mediuminjected ）rats（P0.05）. The number of neuron and oligodendrocyte increased dramatically surrounding the wound（P0.05）, but not astrocyte. Conclusion： Posttransplanlation, OECs secreted CNTF and FGF2, and increased expression of CNTF and F
7、GF2 and the number of neuron and oligodendrayte in the spiual cord.2Key words spinal cord injury; olfactory ensheathing cell; transplantation; ciliary neurotrophic factor; basic fibroblast growth factor脊髓损伤后出现神经元死亡、轴突脱髓鞘、少突胶质细胞丢失等一系列反应，造成轴突的再生失败。神经营养因子供给不足以及胶质瘢痕的形成可能构成了抑制轴突再生的主要因素。尽管如此，轴突在合适的环境中仍可能恢
8、复再生的能力。为了营造适合再生的组织环境，嗅鞘细胞（olfactory ensheathing cells, OECs）移植成为一项很有希望的治疗手段。有实验研究证实，嗅鞘细胞移植后能促进损伤脊髓恢复功能并保护神经细胞1 。虽然嗅鞘细胞在神经保护和促进再生方面的机制还未完全阐明，但其分泌的神经营养因子有可能起关键作用。已知原代培养的嗅鞘细胞能分泌多种营养因子，包括神经生长因子、神经营养素-4/5、神经调节蛋白、脑源性神经营养因子等。有研究表明，嗅球中睫状神经营养因子（ciliary neurotrophic factor, CNTF）在嗅鞘细胞的胞核、胞质和突起中表达2 。此外，嗅鞘细胞在体内
9、还能合成碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, FGF2) 3 。但目前还没有关于嗅鞘细胞移植和 CNTF，FGF2 关系的报道。CNTF 和 FGF2 都能保护神经元，减少其死亡，尤其 CNTF 能促进不同类型的神经元存活。此外，CNTF 和 FGF2 还对少突胶质细胞系起重要的作用，前者能促进少突胶质前体细胞（oligodendrocyte precursor cells，OPCs）的成熟与分化，促进少突胶质细胞合成髓磷脂蛋白，并且防止少突胶质细胞的凋亡4 ；后者能促进少突胶质前体细胞的增殖和迁移，两者具有协同作用。因此，这两种因子在脊髓损伤
10、后对少突胶质细胞的存活及增殖分化起了重要作用。然而，既往的研究报道都是分别关注脊髓损伤后移植嗅鞘细胞的疗效和 CNTF 与 FGF2 对损伤修复的促进作用，还没有关于嗅鞘细胞移植后能否在体内表达 CNTF，FGF2 ，并引起脊髓这两种因子的表达变化，以及这两种因子对脊髓组织神经元和胶质细胞数量有何影响的报道。为了研究这个问题，我们将嗅鞘细胞移植到 SD 大鼠的脊髓半横断损伤部位，检测嗅鞘细胞是否能在体内表达 CNTF 和 FGF2，并观察这两种营养因子在脊髓表达是否增强。由于这两种因子对神经元有保护作用，且对少突胶质细胞的存活和增殖有促进作用，因此本实验还检测了移植后神经元和少突胶质细胞的数量
11、变化。1 材料和方法1.1 嗅鞘细胞纯化培养及纯度鉴定按照李绍波等 5的方法进行。无菌条件下取 1 月龄的 SD 大鼠嗅球最外两层, 经分散后将细胞种植于含 20%胎牛血清的 DMEM/F12 培养基中。采用差速贴壁和阿糖胞苷抑制相结合的方法培养。在培养第 14 天行胶质原纤维酸性蛋白(GFAP) 和神经生长因子受体(NGFRp75) 的免疫细胞化学染色鉴定, 并计算嗅鞘细胞的纯度。1.2 免疫细胞化学染色培养第 14 天进行免疫细胞化学染色。用多聚甲醛固定细胞，CNTF 和3FGF2 免疫荧光细胞化学染色（兔抗 FGF2 ，1200,博奥森；兔抗CNTF，1200, USCN life Sc
12、ience & Technology Company；羊抗兔二抗IgG，1100, 博奥森） ，用 Zeiss 荧光显微镜观察照相。1.3 嗅鞘细胞核荧光及细胞悬液的制备参照朱振东等6的方法进行。加入 Hoechst33342 溶液孵育 30 min,用胰蛋白酶消化及机械分离，制备浓度为 10106 个/ml 细胞悬液。嗅鞘细胞标记后，在荧光显微镜下观察，细胞核呈蓝色荧光。1.4 大鼠半横断损伤模型的建立及嗅鞘细胞移植成年 SD 大鼠，体质量（27020）g，T11T12 脊髓节段间用虹膜剪横断左侧半脊髓。为确保半横断，可用尖刀片在左侧半横断处来回切割 23 次，彻底止血后将明胶海绵填充在半横
13、断处。动物随机分为两组，每组 20 只。移植组（注射细胞组）：损伤后在立体定位仪下用微量加样器（Hamilton）连接的玻璃针（80 m i.d;100 m o.d）立即将准备好的细胞悬液注射到横断处头尾两侧 1.0 mm距中线 0.5 mm 处。注射深度分别为 1.75，1.25 和 0.75 mm，每点在约 30 s 内注射 2 l，另在横断处注射 8 l,共注射 12 l。对照组（注射无血清培养液组）：方法同移植组。1.5 标本处理和免疫荧光组织化学染色术后 7 天和 21 天，动物取材，固定，脱水。用冰冻切片机作脊髓（纵切）的连续切片，片厚 20 m，每组动物取 5 张切片。切片用 2
14、%的牛血清白蛋白封闭 15 min。然后切片置入一抗内孵育。切片所用一抗为：兔抗 GFAP(1200, Sigma)，用来标记星型胶质细胞；小鼠抗 NeuN(11000, Chemicon), 用来标记神经元；兔抗 MBP(1200, Chemicon)，用来标记少突胶质细胞。切片置入荧光素标记的二抗孵育。所用二抗为：马抗小鼠 IgG(1100, 博奥森)。其他同前。用 Zeiss 荧光显微镜观察照相，每张切片取损伤边缘头侧、尾侧和对侧 3 个视野拍照。1010 放大倍数下每张照片实际面积为 1.44 mm2；1020 倍数下为 0.40 mm2。面积测量借助显微目镜测量尺进行（Leitz，7
15、988c） 。1.6 实验数据分析图片用联机 ImagePro 5.0 系统做图像分析，所得各组数据用s 表示；细胞移植组与对照组的数据比较用分组 t 检验，统计分析软件采用 SPSS11.5，数据导入 Excel2003 作图。P0.05 表示差异有统计学意义。2 结 果2.1 嗅鞘细胞在体外表达 CNTF 和 FGF2免疫荧光细胞化学染色显示，培养第 14 天，嗅鞘细胞的核和胞质呈明显的4CNTF 与 FGF2 阳性（图 1） 。2.2 嗅鞘细胞的存活情况移植后 7 天、21 天在脊髓切片中均可观察到大量蓝色细胞核即移植的嗅鞘细胞的细胞核，细胞核数量未见减少，形态正常，未见核固缩和核碎裂。
16、说明嗅鞘细胞移植后在脊髓存活良好。2.3 嗅鞘细胞移植后在体内表达 CNTF 和 FGF2嗅鞘细胞移植入损伤的脊髓后，CNTF 和 FGF2 可在部分细胞的胞核和胞质中检测到（图 2） ，说明移植的嗅鞘细胞能够表达 CNTF 和 FGF2 。2.4 移植前后脊髓 T10 节段 CNTF 和 FGF2 表达变化手术后 7 天和 21 天，脊髓横断处的周边组织均可见 CNTF 和 FGF2 表达。移植组 CNTF 和 FGF2 的表达都明显高于对照组（P0.05） 。见图 3。2.5 移植前后神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞数量的变化术后 7 天和 21 天，移植组神经元和少突胶质细胞的数量高于对照组（P0.05） ，星型胶质细胞的数量和对照组没有明显差异（P0.05） 。见图4,5。3 讨 论本实验将嗅鞘细胞移植入大鼠半横断脊髓后，检测发现嗅鞘细胞在体内表达 CNTF 和 FGF2 ，并
