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1、乳与乳制品中动物水解蛋白鉴定L(-)-羟脯氨酸含量测定法1 主题内容与适用范围本方法规定了乳与乳制品制品中L(-)-羟脯氨酸含量的测定方法。本方法适用于乳与乳制品中L(-)-羟脯氨酸含量的测定。本方法通过对L(-)-羟脯氨酸含量的测定，可判定是否为动物水解蛋白。2 引用标准GB9695.23-90 肉与肉制品L(-) - 羟脯氨酸含量测定 3 原理试样经酸水解,释放出羟脯氨酸。经氯胺T氧化,生成含有吡咯环的氧化物。用高氯酸破坏过量的氯胺T。羟脯氨酸氧化物与对二甲氨基苯甲醛反应生成红色化合物,在波长558nm处进行比色测定。4 试剂所用试剂均为分析纯,水为蒸馏水或同等纯度的水。4.1 氯化亚锡(
2、GB638):0.75溶液。将氯化亚锡7.5g溶于500mL水中,再加入500ml浓盐酸(GB 622)。 4.2 盐酸(GB622):6mol/L溶液。4.3 氢氧化钠(GB629);1mol/L、10mol/L溶液。4.4 缓冲液:将50g柠檬酸,26.3g氢氧化钠和146.1g结晶乙酸钠(GB694)溶于水,稀至1L,此溶液与200mL水和300mL正丙醇混合。4.5 氯胺T(HG3-972)溶液:将1.41g氯胺T,溶于10mL水中,依次加入10mL正丙醇和80mL缓冲溶液(用时现配)。4.6 显色剂:称取10g对二甲氨基苯甲醛,用35mL高氯酸(GB623)溶解,缓慢加入65mL异丙
3、醇。4.7 L(-)-羟脯氨酸(C5H9NO3)标准溶液。4.7.1 标准储备液500g/mL:称取50.0mg/L(-)-羟脯氨酸用少量水溶解,加一滴6mol/L盐酸,定容至100mL容量瓶中。4.7.2 标准工作液5g/mL:吸取标准储备液5.00mL于500mL容量瓶中,定容。 5.1 实验室常规设备。5.2 配有冷凝管的三角瓶:250mL。5.3 恒温水浴。5.4 试管加热器或水浴,可控温于60。5.5 分光光度计。6 试样处理：6.1 方法1：准确称取样品2-5g（液体样品5-10g）放入250mL磨口三角瓶中。加几粒沸石。加入氯化亚锡溶液100mL,置于水浴上加热回流16h。趁热将
4、水解溶液过滤于200mL容量瓶中,用6moL/L热盐酸10mL反复三次冲洗三角瓶和滤纸,冷却,用水定容到刻度,混匀。吸取525mL(V1)水解液于100mL烧杯中,用10mol/L、1mol/L氢氧化钠溶液调节pH为80.2,过滤于250mL容量瓶中,用30mL水冲洗烧杯和滤纸上的氢氧化亚锡沉淀,反复三次,把洗液并入滤液中,以水洗至刻度,摇匀备用。6.2 方法2：准确称取一定量样品，精确到0.0001g。使样品蛋白质含量在1020mg范围内；将称好的样品放于水解管中。在水解管内加6mol/L盐酸1015mL（视样品蛋白质含量而定）或加入12mol/L盐酸1015mL，含水量高的样品（如牛奶）可
5、加入等体积的浓盐酸，加入新蒸馏的苯酚（3.3）34滴，再将水解管放入冷冻剂中，冷冻35min，再接到真空泵的抽气管上，抽真空（接近0 psi），然后充入高纯氮气；再抽真空充氮气，重复三次后，在充氮气状态下封口或拧紧螺丝盖将已封口的水解管放在1101的恒温干燥箱内，水解24h后（如加入12mol/L盐酸，水解时间可缩短至6h）后，取出冷却。 打开水解管，趁热将水解溶液过滤于100mL三角瓶中,用6moL/L热盐酸10mL反复三次冲洗试管和滤纸,冷却,用水定容到刻度,混匀。吸取525mL(V1)水解液于100mL三角瓶中,用10mol/L、1mol/L氢氧化钠溶液调节pH为80.2,过滤于50mL
6、容量瓶中,用水冲洗烧杯和滤纸上的氢氧化亚锡沉淀,反复三次,把洗液并入滤液中,以水洗至刻度,摇匀备用。7 分析步骤7.1 测定7.1标准曲线的绘制吸取L(-)-羟脯氨酸标准工作液0.00,10.00,20.00,30.00,40.00mL,分别置于100mL容量瓶中,定容摇匀。浓度分别为0.0,0.5,1.0,1.5,2.0g/mL。取不同浓度的上述溶液4.00mL,分别加入20mL具塞试管中,加氯胺T溶液2mL,摇匀后于室温放置20min。加入显色剂2mL,摇匀,塞上塞子于60试管加热器(或恒温水浴)中保温20min后取出,迅速冷却,在波长5582nm处测定吸光值,绘制标准曲线。7.2 试样测
7、定从待测液中吸取已制备好的样液4.00mL于20mL具塞试管中,以下按7.1步骤进行,同时作空白试验。8 分析结果的计算CV1A计算公式: X= 100 m1000式中:X样品中L(-)-羟脯氨酸的含量,;C从标准曲线上查得相应的L(-)-羟脯氨酸量,g;m称取试样的质量,g;V1样液体积,mL。A稀释倍数当符合允许差所规定的要求时,取两次测定结果的算术平均值作为结果,结果精确到0.01。9 允许差同一分析者同时或相继进行的两次测定结果之差不得超过平均值的5。10 判定方法因L(-)-羟脯氨酸为胶原蛋白中的特有组分，其含量占10%以上；而乳蛋白中不含有此成分，如若样品中含有L(-)-羟脯氨酸，可判定添加了动物水解蛋白。（以上方法禾工科学仪器从网络收集，未曾检测验证，仅供大家参考）本篇文章来源于 乳与乳制品中动物水解蛋白鉴定L(-)-羟脯氨酸含量测定法|科学仪器在线 原文链接：http:/
