《视网膜母细胞瘤病人体细胞中RB1基因突变的检测【临床医学论文】》由会员分享，可在线阅读，更多相关《视网膜母细胞瘤病人体细胞中RB1基因突变的检测【临床医学论文】（7页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、临床医学论文-视网膜母细胞瘤病人体细胞中 RB1 基因突变的检测作者：盛迅伦，吴伟民，庄文娟，容维宁，王娟，夏美华，章玲【摘要】 目的 检测视网膜母细胞瘤(RB)病人体细胞中 RB1 基因突变，探讨RB1 基因突变的分子生物学机制。方法 应用 PCR-SSCP 技术筛查 RB 病人白细胞基因组 DNA，测序分析确定突变。结果 在 12 例 RB 病人中，确定 3 例 RB1基因生殖细胞性突变。他们分别是第 10 外显子中 T 至 A 杂合性突变， 将苯丙氨酸编码序列变为酪氨酸编码序列；第 10 外显子 1bp 碱基缺失 (GATAT)， 发生阅读框架改变；第 22 外显子中 A 至 T 杂合性
2、突变， 将精氨酸序列变为终止密码。结论 这 3 例 RB1 基因生殖细胞性突变的方式为点突变和小缺失，这些突变改变了 RB1 基因的遗传信息，致使异常的 RB1 基因蛋白产生，导致视网膜母细胞瘤的发生。【关键词】 视网膜母细胞瘤 基因 突变 RB1Detection of heterozygous mutations of RB1 gene in patients with retinoblastoma【Abstract】 Objective To study RB1 heterozygous mutations in patients with retinoblastoma.Methods
3、Genomic DNA was used as a template for the PCR reaction to amplify all exons of RB1 gene.These PCR products were screened by single strand conformation polymorphism (SSCP) and subjected to direct sequencing.Results Three germcell mutations in the RB1 gene were identified in collected genomic DNA fro
4、m RB patients:a T to A transition (TTCTAC) at exon 10，a deletion G (GATAT) at exon 10，a A to T transition (AAGATG) at exon 22.Conclusion Mutations in RB1 gene are involving a few base pairs in this study.As a result of such mutation，the normal function of RB is usually disrupted，and retinoblastoma o
5、ccurred. 【Key words】 retinoblastoma gene mutation RB1视网膜母细胞瘤（简称 RB），是婴幼儿最多见的高度恶性、致死率高的眼内恶性肿瘤。由视网膜母细胞瘤基因(RB1 基因)的两条等位基因同时失活所致，分遗传型（30%40%）和非遗传型（60%70%）两种方式。遗传型视网膜母细胞瘤病人体细胞都携带 RB1 基因生殖细胞性突变，85%90%可能会发生双眼或单眼多灶型视网膜母细胞瘤，下一代子女中约有 50%的机会遗传这一突变的基因，而其中的 90%会患视网膜母细胞瘤1，2。因而，基于 RB1 基因生殖细胞性突变检测(遗传分型、产前与症状前基因诊断)，
6、目前是视网膜母细胞瘤的预防与早期诊断的有效途径。为了进一步了解 RB 病人 RB1 基因的突变特点，为临床遗传检查提供更多可靠的信息，笔者应用分子生物学技术对 RB 病人体细胞中 RB1 基因进行突变位点的检测，并结合以前的工作3，探讨了 RB1基因突变的分子生物学机制。1 资料与方法1.1 一般资料 共收集散发 RB 病人 12 例，4 例为双眼 RB，其它 8 例为单眼 RB，年龄 15 岁；同时收集了 12 例无亲属关系的健康人作为正常对照组。1.2 方法1.2.1 DNA 提取 采外周静脉血 10ml，应用 DNA 分离试剂盒（Promega 公司产品）提取全血白细胞 DNA。1.2.
7、2 聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR） 应用美国PE 公司 2400 型 PCR 仪。参照 Toguchida4报道的方法进行 PCR 引物设计。PCR 反应体系：10Buffer 2l（含 MgCl2 10 mmol/L），2dNTP 2l （2mmol/L）引物 2l（10mmol/L），DNA 模板 1l （1mmol/L），Taq plus I DNA 聚合酶 0.5l（510u/L），加双蒸水至 100l。95变性 1min 进入循环。95 30s，退火 30s，退火温度 5070（不同外显子，不同温度）。72延伸 30s，共 30 个循环。最
8、后 72 再延伸 7min。PCR 扩增产物的分析：取扩增产物 5l 在 1.5%琼脂糖凝胶电泳后进行 EB 染色，同时加 Marker 标记DNA 相对分子质量。透射紫外线观察 DNA 电泳带，照相。1.2.3 单链构象多态性（single strand conformation polymorphism，SSCP） 分析 将 PCR 产物置 95下变性 10min，加入 10%非丙烯酰胺电泳槽孔中，50，2h，电压 200400V，银染、显带、干燥。1.2.4 DNA 测序 通过 SSCP 分析如发现有变异带出现，则将该 PCR 产物利用双脱氧末端终止法进行直接测序。2 结果通过 PCR-
9、SSCP 分析，在 12 例病人中发现 3 例 SSCP 电泳有变异 DNA 单链带（图 13）。其中 2 例经临床及病理检查确诊为双眼 RB，1 例为单眼 RB。这3 例病人均无家族史。PCR 产物克隆测序分析显示:例 1(3 号)双眼 RB 病人 10 号外显子 5端至 3端第 22bp 处发生 TA 置换，由 TTC 变为 TAC，将苯丙氨酸编码序列变为酪氨酸编码序列(图 1)；例 2(7 号)双眼 RB 病人 10 号外显子 5端至 3端第 64bp 处发生 1bp 碱基缺失(GATAT) (图 2)，发生阅读框架改变；例 3(14 号)22 号外显子 5端至 3端第 36bp 处发生
10、 AT 置换，由 AGA 变为TGA，将精氨酸序列变为终止密码(图 3)。图 1 图 2图 3图 1 A：SSCP 电泳图：例 1 双眼 RB 患儿，10 号外显子电泳带显示超前的异常泳动带形（第 1 号标本）；B：RBI 基因突变测序图：10 号外显子第 64352 碱基处发生 TA 置换（TTCTAC）图 2 A：SSCP 电泳图：例 2 以眼 RB 患儿，10 号外显子电泳带显示超大型前的异常泳动泳动带形（第 1 号标本）；B：RBI 基因突变测序图：10 号外显子第 64352 碱基处发生 Ibp 碱基缺失（GATAT）图 3 A：SSCP 电泳图：例 3 单眼 TB 患儿，22 号外
11、显子电泳 带显示滞后的异常泳动带形（第 1 号标本）；B：RBI 基因突变测序图：22 号外显子第 162137 碱基处发生 AT 置换（AGATGA）3 讨论 RB1 基因（视网膜母细胞瘤易患基因）位于人类 13 号染色体长臂 1区 4 带，有 27 个外显子，分布范围 180kb，转录一 4.7kbmRNA，其蛋白产物为一 115kb 核内磷酸蛋白。各种原因致使 RB1 基因失活是视网膜母细胞瘤发生的直接原因。RB 分遗传性和非遗传性两种。遗传性和非遗传性病例发病特征的差别可以用 Knudson 的二次突变学说解释。Knudson 于 1971 年提出的二次突变学说认为RB 发生要经历两次
12、突变。遗传性第一次突变是生殖细胞突变，由此发育而来的子代所有体细胞均带有一次突变，表现肿瘤易感性。视网膜任何一个细胞只需发生一次突变即可发生 RB，而其它部位体细胞也只需一次突变即可发生恶性肿瘤，故 RB 发生早，多中心，发生第二肿瘤危险性高，且可遗传。这种生殖细胞突变可以来自病人父母的遗传（有家族史），但以胚胎发育早期的生殖细胞新发生的突变更多见（无家族史），非遗传型 RB 病人中，生殖细胞遗传了正常的两个 RB 基因，两次突变需发生于同一视网膜细胞才可能发病。因为同一细胞连续发生两次突变可能性非常小、故这些病例总是单侧单中心性发生，且发病晚。而所有体细胞遗传了正常的 RB 基因。所以发生二
13、次恶性肿瘤的危险性与正常人相同2。国内临床上对视网膜母细胞瘤做出诊断时大多数患儿已近晚期，只好行眼球摘除术以保性命。应用分子生物学及分子遗传学方法检测 RB1 基因突变，结合基因连锁分析，可在分子水平上进行 RB1 的产前及产后早期诊断和遗传咨询。应用 PCRSSCP 直接测序方法可以检测出病人体细胞内 RB1 基因的杂合突变，尤其是对那些得不到肿瘤标本的病例更为适用。SSCP 技术具有较高的敏感性，可检测至序列中单一碱基的变化。内部结构有变化的单链 DNA 片段在电泳中发生迁移率的变化，使相应的 DNA 电泳带超前或滞后异于正常应有的位置。对于经 SSCP 检测所发现有结构异常的标本，再对其
14、进行序列分析。本研究中 2 例10 号外显子电泳带显示超前的异常泳动带形，1 例 22 号外显子电泳带显示滞后的异常泳动带形。经 DNA 测序均发现 RB1 基因突变。PCR-SSCP 可检出标本 DNA结构异常的存在。且处理标本量大、迅速，适用于目的基因结构异常的筛选，联合序列分析，则可最终证实基因改变的类型及确切存在的部位。RB1 基因突变发生的种类：以碱基变化为标准5，可以将突变分为点突变（置换与颠换）、小缺失、小插入及复杂突变 4 类。申煌煊6在分析 21 个 RB1 基因组成型突变中发现，中国人的 RB1 基因突变虽然也有 4 种不同的突变方式，但以微小突变为主。笔者采用 PCR-S
15、SCP-直接测序技术对 12 例 RB 病人 RB1 基因进行了研究，分析了血液白细胞中的 RB1 基因的启动子及 27 个外显子，发现 3例 RB1 基因生殖细胞性突变，2 例为双眼 RB 病人，1 例为单眼 RB 病人。笔者所确定的 4 例（本文 3 例，以前 1 例）RB 病人和 1 例表现型正常的 RB1 基因突变携带者3，其生殖细胞性突变方式为点突变和小缺失，均为微小突变。点突变往往改变了正常的遗传信息。本研究中标本 3 第 10 外显子 5端至 3端第22bp 处发生 T 至 A 突变，将苯丙氨酸编码序列变为酪氨酸编码序列；标本 14第 22 号外显子第 36bp 处发生 A 至
16、T 突变，将精氨酸序列变为终止密码，这就不可避免地影响了 RB1 基因编码的蛋白质的质量。RB1 基因的缺失改变可因破坏阅读框架，产生终止密码而影响正常转录，标本 7 第 10 外显子第 64bp 处发生 1bp 碱基缺失，发生阅读框架改变。这些改变均导致 RB1 基因不能完成正常的转录过程而不能编码出正常的 RB 蛋白，从而失去了对视网膜细胞的生长、分化的负反馈调节作用，使细胞生长处于无限制地生长状态，致使视网膜母细胞瘤的发生。RB 基因的检测和定性加深了笔者对人类肿瘤的理解，在肿瘤发病的分子机制及利用突变分析进行遗传咨询方面取得了很大进步。RB 基因突变携带者的检测非常重要，因为它不仅引起 RB，还可导致其它肿瘤。更好地认识 RB1 基因突变的不同类型，不仅对 RB 发病机制的认识有重大理论指导意义
