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1、第七章 目的基因在宿主中的表达,2011-10-22,1,目的基因在宿主中的表达,外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在酵母菌中的表达 外源基因在哺乳动物细胞中的表达 外源基因在高等植物细胞中的表达,2011-10-22,2,目的基因在宿主中的表达,绪：基因表达的关键因素,1.转录起始（关键和限速步骤）,转录 宿主RNA聚合酶 启动子,2011-10-22,3,目的基因在宿主中的表达,2.mRNA的延伸与稳定性,非特异性终止:衰减子,抗终止序列 正确终止转录：终止序列 mRNA稳定性与Poly(A)尾有关 载体上添加 Poly(A)掺入信号 宿主RNase缺失,增强mRNA稳定性,2011-1
2、0-22,4,目的基因在宿主中的表达,强化转录终止的必要性,外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑 过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物。,过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下：,转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因本身的转录效率下降。,如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域，如选择性标记基因和复制子结构等，则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性。,过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程
3、菌无谓的能量消耗。,更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率。,2011-10-22,5,目的基因在宿主中的表达,3mRNA有效翻译,原核翻译 AUG起始密码子 SD序列:与16SrRNA互补结合位点，该序列至少含有AGGAGG序列中的4个碱基 SD序列与ATG之间合适距离3-9bp 翻译起始区间内不形成明显二级结构 (5)终止密码子：UAA 、UAG、UGA,2011-10-22,6,目的基因在宿主中的表达,4外源蛋白的稳定性,融合蛋白 分泌蛋白表达系统 包涵体表达系统 使用蛋白水解酶基因缺陷型受体细胞,2011-10-22,7,目的基因在
4、宿主中的表达,5.目的基因的沉默,1）位置效应 目的基因位于甲基化程度高，转录活性低的异染色质上 2）转录水平基因沉默 启动子甲基化和外源基因的异染色质化； 目的基因的重复序列可导致自身甲基化 3）转录后水平基因沉默 共抑制 (cosuppression)是转录后水平的基因沉默，指被整合的外源基因沉默的同时，与其同源的内源DNA的表达也受到抑制。,2011-10-22,8,目的基因在宿主中的表达,一、外源基因在大肠杆菌中的表达,2011-10-22,9,目的基因在宿主中的表达,1.大肠杆菌表达外源基因的优势,全基因组测序，共有4405个开放阅读框,基因克隆表达系统成熟完善,繁殖迅速、培养简单、
5、操作方便、遗传稳定,被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物,2011-10-22,10,目的基因在宿主中的表达,2.大肠杆菌表达外源基因的劣势,缺乏对真核生物蛋白质的复性功能,缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统,内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白,细胞周质内含有种类繁多的内毒素,2011-10-22,11,目的基因在宿主中的表达,3.外源基因在大肠杆菌中高效表达的理论基础,启动子,终止子,核糖体结合位点,密码子,质粒拷贝数,2011-10-22,12,目的基因在宿主中的表达,3.1 启动子,目的基因,(1)启动子最佳距离的探测,A,E,E,目的基因 E,E,A 酶切开,启动子 Bal3
6、1酶解,2011-10-22,13,目的基因在宿主中的表达,PL,Ptrp,(2)启动子的构建,启动子 PrecA PtraA Plac Ptac,-35 区序列 T T G A C A T T G A T A T A G A C A T T G A C A T T T A C A T T G A C A,-10 区序列 G A T A C T T A T A A T T A A T G T T T A A C T T A T A A T T A T A A T,Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac,2011-10-22,14,目的基因在宿主中的表达,(3)启动子的可控性：乳糖操纵子
7、的启动子Plac,野生型的Plac与其控制区Olac 偶联在一起，在没有诱导物 存在时，整个操纵子处于基 底水平表达；诱导物可以使 启动子Plac介导的转录大幅提 高。,诱导作用,2011-10-22,15,目的基因在宿主中的表达,(3)启动子的可控性：乳糖操纵子的启动子Plac,野生型的Plac上游附近拥有代谢激活因子（CAP）结合区，cAMP激活CAP，cAMP-CAP复合物与DNA结合，改变DNA结构，促进RNA聚合酶和启动子结合，使转录能力增强。葡萄糖代谢使cAMP减少，从而阻遏Plac介导的转录。因此，基因工程中使用的乳糖启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的 突变型，即Plac UV5。,c
8、AMP的正调控作用,2011-10-22,16,目的基因在宿主中的表达,(3)启动子的可控性：色氨酸启动子Ptrp的可控性,色氨酸启动子Ptrp受色氨酸-阻遏 蛋白复合物的阻遏，转录呈基底 状态。在培养系统中去除色氨酸 或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA）， 便可有效地解除阻遏抑制作用。 在正常的细菌培养体系中，除去 色氨酸是困难的，因此基因工程 中往往添加IAA诱导Ptrp介导的目 基因的表达。,2011-10-22,17,目的基因在宿主中的表达,3.2 终止子,2011-10-22,18,目的基因在宿主中的表达,强终止子的选择与使用 目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌 rRNA操
9、纵子上的rrnT1T2以及T7噬菌体DNA上的T。对 于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终 止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用。 终止子、启动子等，可以通过特殊的探针质粒从细菌或 噬菌体基因组DNA中克隆筛选。,3.3 核糖体结合位点RBS,外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的 频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。大 肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之 间的差别有时可高达数百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其5 端 的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS，Ribosome Binding Site）,20
10、11-10-22,19,目的基因在宿主中的表达,(1)核糖体结合位点的结构,大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素：,位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5 UAAGGAGG 3：即,Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中,的16S rRNA 3端区域3 AUUCCUCC 5并与之专一性结合，将,mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译。,翻译起始密码子：大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架的起 始位点，但有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子。,SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成,基因编码区5 端若干密码子的碱基序列,201
11、1-10-22,20,目的基因在宿主中的表达,(2)核糖体结合位点对外源基因表达的影响,SD序列的影响：,一般来说，mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效 率就越高，而这种结合程度主要取决于SD序列与16S rRNA的碱 基互补性，其中以GGAG四个碱基序列尤为重要。对多数基因而 言，上述四个碱基中任何一个换成C或T，均会导致翻译效率大幅 度降低。,2011-10-22,21,目的基因在宿主中的表达,SD序列与起始密码子之间的序列的影响：,SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU，翻译效率最高；而 CCCC或GGGG的翻译效率则分别是最高值的50%和25%。紧邻 AUG的前三个碱基成份对
12、翻译起始也有影响，对于大肠杆菌-半 乳糖苷酶的mRNA而言，在这个位置上最佳的碱基组合是UAU或 CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，则酶的表达水平低20 倍。,2011-10-22,22,目的基因在宿主中的表达,SD序列与起始密码子之间的距离的影响：,SD序列与起始密码子之间的精确距离保证了mRNA在核糖体 上定位后，翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P 位，这是翻译启动的前提条件。在很多情况下，SD序列位于AUG 之前大约七个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均 会导致翻译起始效率不同程度的降低。,2011-10-22,23,目的基因在宿主中的表达,起始密码子
13、及其后续若干密码子的影响：,大肠杆菌中的起始tRNA分子可以同时识别AUG、GUG和UUG 三种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常GUG为AUG的50% 而UUG只及AUG的25%。除此之外，从AUG开始的前几个密码子碱 基序列也至关重要，至少这一序列不能与mRNA的5 端非编码区形 成茎环结构，否则便会严重干扰mRNA在核糖体上的准确定位。,目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上，均含有 与启动子来源相同的核糖体结合位点序列，序列和间隔是最佳的。,2011-10-22,24,目的基因在宿主中的表达,3.4 密码子,（1）生物体对密码子的偏爱性,不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质
14、编码基因，对简并密码 子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性，其决定因素是：,密码子与反密码子相互作用的自由能：性中等强度规律,如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少； 如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多；,细胞内tRNA的含量,生物基因组中的碱基含量：在富含AT的生物（如单链DNA噬菌体X174）基因组中，密码子第三位上的U和A出现的频率较高；而在GC丰富的生物（如链霉菌）基因组中，第三位上含有G或C的简并密码子占90%以上的绝对优势。,2011-10-22,25,目的基因在宿主中的表达,Codon Usage Datab
15、ase,Aspergillus oryzae,Aspergillus niger,Saccharomyces cerevisiae,Escherichia coli,2011-10-22,26,目的基因在宿主中的表达,（2）密码子偏爱性对外源基因表达的影响,由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程度的差异性，因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。一般而言，有两种策略可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达：,外源基因全合成 同步表达相关tRNA编码基因,2011-10-22,27,目的基因在宿主中的表达,外源基因全合
16、成,按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律，设计更换外源基因中不适 宜的相应简并密码子。重组人胰岛素、干扰素以及生长激素在 大肠杆菌中的高效表达均采用了这种方法。,实验技术：密码子优化,http:/genomes.urv.cat/CAIcal/ OPTIMIZER,2011-10-22,28,目的基因在宿主中的表达,同步表达相关tRNA编码基因,对于那些含有不和谐密码子种类单一、出现频率较高、而本身分 子量又较大的外源基因而言，则选择相关tRNA编码基因同步克隆表达 的策略较为有利。 例如，在人尿激酶原cDNA的412个密码子中，共含有22个精氨酸密码子，其中7个AGG、2个AGA，而大肠杆菌受体细胞中tRNAAGG和tRNAAGA的丰度较低。为了提高人尿激酶原cDNA在大肠杆菌中的高效表达，将大肠杆菌的这两个tRNA编码基因克隆在另一个高表达的质粒上。由此构建的大肠杆菌双质粒系统有效地解除了受体细胞对外源基因高效表达的制约作用。,2011-10-22,29,目的基因在宿主中的表达,3.5 质粒拷贝数,（1）质粒拷贝数对细菌生长代谢的
