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1、临床医学论文-纤维粘连蛋白 EDA+片段在退变椎间盘中的表达及其意义作者：胡宝山，丁悦，李春海，刘尚礼，吕浩然，叶伟【关键词】 椎间盘退变摘 要：目的检测退变椎间盘内 EDA+ Fn 的表达，探讨损伤在椎间盘退变中的作用。方法收集人腰椎间盘退变临床手术标本，经病理证实均发生退变，采用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）技术扩增目标条带。结果正常椎间盘内没有 EDA+ Fn 的表达，而退变椎间盘内均有 EDA+ Fn 的表达；中重度退变者 EDA+ Fn 的表达较轻度退变者为多（轻中度组间 P=0016005；轻重度组间 P=0007005），中重度之间则没有明显差别（P0501）。结论EDA+ F
2、n 在退变椎间盘内有较高表达，直接证明损伤是椎间盘退变的重要的致病因素之一。关键词：椎间盘退变； 纤维粘连蛋白； 可变剪接Abstract：ObjectiveTo study the relationship between trauma and the lumbar disc degeneration and to detect the expression of the fibronectin splicing variants in the degenerated lumbar intervertebral disc,and study the expression of EDAMeth
3、odThe human lumbar intervertebral disc tissues were collected to extract total RNA which was then amplified by RTPCR techniqueResultEDA+ Fn of normal lumbar intervertebral disc were not expressed,whereas EDA+ Fn of degenerated lumbar intervertebral disc were expressed abundantlyThe defference betwee
4、n different groups has statistical significanceConclusionEDA+ Fn has very strongly expression in the lumbar degenerated intervertebral disc,and the trauma is one of prerequisite factors in the disc degenerated process probablelyKey words：Intervertebral disc degeneration; Fibronectin; Alternative spl
5、icing下腰痛是脊柱外科的常见病，其中椎间盘退变为其主要原因之一，椎间盘退变的病因包括年龄、创伤、遗传等因素。但究竟何种机理启动退变，目前尚不清楚。椎间盘退变机理的研究是目前国内外脊柱外科研究的热点。纤维粘连蛋白（fibronectin，Fn）是一种大的纤维状糖蛋白，在机体内广泛存在，已证实其可变性剪切异形体 EDA+ Fn 与损伤关系密切，常常作为损伤鉴定的标志。同时发现 EDA+ Fn 能够体外诱导某些与椎间盘退变关系密切的细胞因子、相关酶类的表达。本研究检测正常和退变椎间盘组织中 EDA+ Fn 的表达，探索椎间盘退变的机理。1 材料与方法11 主要材料与试剂退变椎间盘标本取自椎间盘突
6、出症患者手术摘除的标本，共 10 例，均经病理证实有腰椎间盘退行性变。对照组 3 例椎间盘组织标本，取自新鲜尸体，经病理检查未见退变表现。取出组织立即液氮冷冻后，放入零下 80 保存备用。RNA 提取试剂盒（美国 MRC 公司）；RT 试剂（Promega 公司）；PCR 试剂盒（TaKaRa 宝生物工程公司）：引物由上海生工生物工程公司合成，分别为：EDA，5GAC TAT TGA AGG CTT GCA GCC3（sense），5CTT GTG GGT GTG ACC TGA GTG3（antisense）（扩增长度包含 EDA 片段 495bp，不包含 EDA 片段 356bp）;GAP
7、DH，5TCT TCT TIT GCG TCG CCA GC3（sense），5GAG GCA GGG ATG ATG TTC TG3（antisense）（扩增长度 453 bp）。12 MRI 确定椎间盘退变与否的标准取矢状位 MRI T2 加权图像，重复时间 2 500ms，回波时间 90 ms。图像由有经验的专业医师行双盲评定。结果按 Schneidermans 分级，标准为：1 级（正常）：正常信号强度；2 级（轻度）：椎间盘信号轻度减低；3 级（中度）：信号重度减轻；4 级（重度）：椎间盘信号完全消失。对照组均为 1 级，实验组2 级 4 个标本，3 级 3 个标本，4 级 3 个
8、标本。13 RTPCR 反应 液氮研磨各组组织标本后，抽提总 RNA，进行 RTPCR 扩增，每管加入待测基因引物进行扩增，EDA 扩增 PCR 反应体系采用 94 5min、94 30s、56 30s、72 30s 进行 30 个循环，总反应体系 50 l。GAPDH 反应条件与 EDA相同，反应结束后，取 5 l 反应产物加入 2 l 6上样缓冲液，1 l 金胶体，2琼脂糖电泳，UVP 凝胶成像，利用凝胶分析软件，用待测 EDA+基因与内参基因扩增的特异性条带的光密度积分值的比值反应待测基因表达的强弱。标准分子量参照 TaKaRa 公司 100 bp DNA Ladder（长度分别为100
9、、200、300、400、500、600、700、800、900、1 000bp）。14 统计学处理实验数据均以均数标准差（x-s）表示，采用方差分析，监测各组之间mRNA 的表达有无统计学意义。2 结 果正常和退变椎间盘标本均扩增出 EDA+片段（356 bp）高亮度条带，其中正常椎间盘组（n=3）均没有 EDA+ 片段（495 bp）表达（图 1）。退变组均有EDA+ 片段的表达，以内参为标准（图 2），进行半定量分析发现，EDA+ 片段表达与椎间盘退变的程度关系密切，中重度退变者 EDA+ Fn 的表达较轻度退变者为多（轻中度组间 F=12769，P=0016005；轻重度组间F=198
10、20，P=0007005），中重度之间则没有明显差别（F=0545，P=0501005）。 图 1EDA 片段 mRNA 在退变椎间盘中的表达 注：从左至右 M：DNA marker;Nor:正常组；D1：轻度退变组；D2：中度退变组；D3：重建退变组。扩增片段：EDA+片段（495 bp 上方条带）；EDA+片段（356 bp 下方条带）；marker 为 1001 000bp 图 2 各标本的 GAPDH 内参条带（453 bp）3 讨 论 下腰痛是脊柱外科的常见病和多发病。是导致成人丧失劳动能力的主要疾病之一1。下腰痛的主要原因为椎间盘退变，对于椎间盘退变患者，目前临床上多先采用保守治疗
11、，症状不能缓解的患者，采用手术治疗，远期优良率在70左右，疗效并不理想2。因为减压和融合的治疗方法不能恢复和保持椎间关节的正常结构与生理功能，不能减缓椎间盘退变的进程，从而有效治疗椎间盘退变需要新的治疗方法，鉴于此，揭示腰椎间盘退变的原因和机理显得尤为重要。Fn 是一种大的纤维状糖蛋白，它具有同时与细胞周基质中多种成分相结合的功能，所以又被称为“中心因子”。EDA 基因片段是 Fn 基因上的可变性剪接片段，在正常组织中除脑、肝、肺的 Fn 外极少有 EDA 片段的表达，在损伤组织中，EDA 可有高表达，因此推测损伤过程中 Fn 对炎症细胞的趋化作用，对成纤维细胞的诱导分化，均与 EDA 的表达
12、有关3。在法医学损伤时间推断的研究中，EDA 作为一种比较理想的指标越来越受到重视。在风湿性关节炎患者的关节液中 EDA+ Fn 明显增高，且与患者关节毁损程度呈正相关，即 EDA+ Fn 浓度高的关节毁损率较高。在体内发现一种 160 Kda 的 EDA+ Fn 能诱导 MMP1 的表达，同时体外实验发现 EDA+ 的 Fn 片段能够上调 IL1 的表达，促进 MMPs 的表达，降解蛋白产物，诱导型胶原的表达1。目前所知的腰椎间盘退变过程为某种始发因素启动细胞或基质内炎症介质的产生、蛋白酶类的激活、结果导致型胶原增多，型胶原降解，浓度降低，、型胶原比例失调，最终产生临床相应表现5，与 EDA
13、+ Fn 在机体损伤组织修复的过程中所表现出的变化基本相同。已有研究表明组织损伤后 Fn 基因表达发生变化，EDA+ Fn 大量表达，诱导炎症介质的产生，启动细胞膜和细胞中各种信号传导酶类的激活，成纤维细胞的增殖，型胶原的增多，进而以瘢痕组织初步完成损伤组织的修复。因此推测腰椎间盘退变过程中，损伤是必不可少的条件，虽然型胶原的增多，瘢痕组织的形成是组织修补的正常过程，但因为椎间盘组织的特殊性，导致这种正常的修复过程变成一种病理过程，从而促进椎间盘退变。但对于 EDA+ Fn 在退变椎间盘中是否有所表达、表达程度如何，EDA+ Fn 在椎间盘内是否能够导致型胶原的减少、型胶原的大量增生仍不清楚。
14、本文首次探讨了退变椎间盘内的 EDA+ Fn 的表达情况。结果表明，正常椎间盘内未见 EDA+ Fn 的表达，所有退变椎间盘内均见 EDA+ Fn 的表达，而且根据 MRl 分级对电泳结果进行半定量分析发现中重度退变者 EDA+ Fn 的表达较轻度退变者为多，中重度之间则没有上接 372 页）明显差别。结合 EDA+ Fn 的与组织损伤的相关性，这一结果说明损伤为椎间盘退变发生的重要致病因素。其它致病因素可能为椎间盘损伤提供了倾向性，例如遗传因素、年龄因素等均使椎间盘更容易受到“伤害”。在损伤后，椎间盘内启动组织修复机理，即炎症介质和蛋白酶类被激活、成纤维细胞增殖、型胶原增多、型胶原比例失调等
15、，使椎间盘生物力学发生变化，导致纤维环结构的破坏和髓核脱水。本实验直接证明了椎间盘退变可能和损伤因素有着更为紧密的联系，对以往流行病学调查结果表明的职业因素和创伤是其致病因素的直接证明6。椎间盘退变过程中，损伤可能是必不可少的条件，其它致病因素均为辅助因素。对于 EDA+ Fn 在椎间盘内具体作用还不清楚，是否能够导致炎症介质的产生，相关酶类的变化，胶原比例失调还不可知，相关研究正在进行之中。参考文献：1 Hashemi L,Webster BS,Clancy EA.Trends in disability duration and cost of workers compensation l
16、ow back pain claims（19881996）J.J Occup Environ Med,1998,40（12）:11101119.2 Yorimitsu E,Chiba K,Toyama Y,et al.Longterm outcomes of standard discetomy for lumbar disc herniation:a followup study of more than 10 yearsJ.Spine,2001,26（6）:652657.3 Saito S,Yamaji N,Yasunaga K,et al.The fibronectin extra domain a activates matrix metaloproteinase gene expression by an interl
