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1、医学论文-秦巴山区孕妇人巨细胞病毒宫内感染与UL54、UL97 基因突变的关系作者：盛秋，李芬，于学文，李琦，韩蓁，李学成，任永惠 【摘要】 目的 探讨秦巴山区孕妇妊娠期人巨细胞病毒(HCMV)宫内感染与HCMV UL54、UL97 基因突变的关系。方法 采用 PCR 方法检测 228 对孕妇血清和新生儿脐血血清中的 HCMV DNA，对 HCMV DNA 阳性者采用限制性片段长度多态性(PCRRFLP) 方法检测 HCMV UL54、UL97 基因 501、594 及 595 密码子是否发生突变。结果 228 例孕妇血清中 HCMV DNA 阳性者 19 例，阳性率为 8.33%；新生儿脐血
2、血清中 HCMV DNA 阳性 8 例，阳性率为 3.51%。在 19 例 HCMV DNA 阳性孕妇中，其配对脐血阳性 7 例，HCMV 宫内传播率为 36.84%。HCMV DNA 阳性孕妇血清及其配对脐血阳性的标本中均未发现 HCMV UL54、UL97 基因501、594 及 595 密码子发生突变。结论 秦巴山区 HCMV 宫内感染的发生率较高，其发生与 HCMV UL54、UL97 基因 501、594 及 595 密码子突变无相关性，但不排除存在其它位点突变或其它形式基因异常导致病毒致病性改变的可能性。 【关键词】 人巨细胞病毒；HCMV 宫内感染；基因突变人巨细胞病毒(huma
3、n cytomegalovirus, HCMV)是人类先天性感染的常见原因之一，在人群中感染广泛。孕妇感染 HCMV 后可导致流产、早产、死胎、胎儿宫内发育迟缓、新生儿先天畸形、新生儿并发症及远期后遗症等。本课题既往对秦巴山区的研究调查表明，该地区孕妇孕期 HCMV 感染率为 19.59%，明显高于国内外文献的报道1。目前对 HCMV 导致胎儿损害的机制尚不能做出完善的解释。近年来，从分子水平研究 HCMV 的发病机制是倍受关注的热点。本研究在国内首次采用分子生物学的方法探讨秦巴山区孕妇妊娠期宫内 HCMV 感染与基因突变的关系，以期揭示其发病机理，采取有效的防治措施，最终达到提高出生人口素质
4、的目的。1 资料与方法1.1 研究对象 选取 2002 年 5 月至 2005 年 7 月秦巴山区 2 县 4 乡住院分娩的单胎孕妇228 例作为研究对象。孕妇年龄 20-36(25.832.23)岁，孕周 35-41 周，其中自然分娩 189 例，剖宫产 39 例(均为产科因素)。分娩时成对采集孕妇肘静脉血及新生儿脐带血(脐血在胎儿娩出后未断脐时于脐带胎儿端抽取)，每份样本5mL，分离血清后于-70保存。所有孕妇均无妊娠合并症，无风疹病毒、弓形虫及单纯疱疹病毒活动性感染，且排除家族性遗传性疾病。1.2 方法1.2.1 基因片段的 PCR 扩增 盐析法提取 HCMVDNA 。UL54 基因的扩
5、增及检测：所用引物为5CGCCACCAAGGTGTATAT 3 和 5AGTGGTTGGGCAGGATAA 3，反应体系为 25L。体系中含有 10PCR Buffer 2.5L，dNTP 混合液 0.5L，MgCl2(25mmol/L)1.5L，引物混合液 0.5L，模板 2L，TaqDNA 聚合酶(u/L)1L，无菌去离子水 17L，无菌液体石蜡20L。循环条件为：94.5 50s，55 45s，72 50s，共 35 个循环，最后72 7min。20g/L 琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。UL97 的扩增及检测：所用引物为 5CGGTCTGGACGAGGTGCGCAT3 和 5 AATGAG
6、CAGACAGGCGTCGAAGCAGTGCGTGAGCTTGAAGTTCTT 3。反应体系同上。循环条件为：94.5 1min，51 45s，72 50s，共 40 个循环，最后 72 7min。20g/L 琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。1.2.2 PCRRFLP 检测基因突变 UL54 基因 501 密码子的检测：扩增后的 UL54 片断用限制性内切酶Alu在 37水浴箱 2h 进行酶切，3g/L 琼脂糖凝胶检测酶切结果。UL97 基因 594、594 密码子的检测：扩增后的 UL97 片断分别用限制性内切酶 Hha在37水浴箱 2h 进行酶切及 Taq在 65水浴 2h 进行酶切，酶切产物
7、用 100g/L聚丙烯酰氨凝胶电泳检测。1.3 统计学处理 采用 SPSS11.0 软件对数据进行处理，计数资料采用 Fisher 精确概率法进行统计学检验，显着性标准为 =0.05。2 结 果2.1 孕妇 HCMV 宫内感染情况 228 例配对血中，孕妇血清 HCMV DNA()19 例，阳性率为 8.33%；新生儿脐血血清 HCMV DNA()8 例，阳性率为 3.51%。在 19 例 HCMV DNA()孕妇中,其配对脐血阳性 7 例， HCMV 宫内传播率为 36.84%；209 例 HCMV DNA(-)的孕妇血清中脐血阳性 1 例，阳性率为 0.48%。可见孕期 HCMV 活动性感
8、染与胎儿宫内感染有显着相关性(255.11，P0.005)。2.2 孕妇血清及新生儿脐血中 HCMV DNA 的检测 经 PCR 扩增后得到 UL54 的扩增片段，产物为核苷酸 2075-2460，长度为386bp，其中包含密码子 501(图 1)。经 PCR 扩增后得到 UL97 的扩增片段,产物为核苷酸 1713-1830，长度为118bp,其中包含密码子 594 和 595(图 2)。2.3.1 UL54 密码子 501 突变 在 HCMV 野生型病毒株的上述 UL 54 片段扩增产物中包含一个 Alu识别位点，被 Alu消化后产生 283bp 和 103bp 两个片段；在 HCMV 突
9、变病毒株中核苷酸 2160 处的碱基 TC，密码子 501 发生改变，Alu酶切后可产生283bp、85bp 和 18bp 三个片段。本研究 HCMV DNA 阳性孕妇血清及其配对脐血阳性的标本中，上述 UL54 扩增片断产物经 Alu酶切后，只见到 283bp 和103bp 两个片段，提示病毒株密码子 501 未发生突变(图 3)。2.3.2 UL97 密码子 594 和 595 突变 在 HCMV 野生型病毒株的上述 UL 97 扩增片段产物中包含 4 个 Hha识别的位点，被 Hha消化后产生 50bp、38bp、18bp 和 12bp 四个片段；在突变株中密码子 594CT，减少一个
10、Hha识别位点，Hha酶切后产生 62bp、38bp 和18bp 三个片段。本研究 HCMV DNA 阳性孕妇血清及其配对脐血阳性的标本中，在上述 UL 97 扩增片断经 Hha酶切后，只见到 50bp 和 38bp 两个片段(18bp和 12bp 由于片段太小跑出胶)，提示病毒株密码子 594 未发生突变(图 4)。在 HCMV 野生型病毒株的上述 UL 97 扩增片段产物中包含 1 个 Taq识别位点，被 Taq消化后产生 99bp 和 19bp 两个片段；突变株密码子 595 TC，增加了一个 Taq识别位点，Taq酶切后产生 71bp、28bp 和 19bp 三个片段。本研究 HCMV
11、 DNA 阳性孕妇血清及其配对脐血阳性的标本中，上述 UL 97 扩增片断经 Taq酶切后，只见到 99bp(19bp 由于片段太小跑出胶)，提示病毒株密码子595 未发生突变(图 5)。3 讨 论HCMV 在自然界中广泛存在，人群中存在高感染率。在我国孕妇 HCMV 的感染率为 70%-80%23 。HCMV 可通过宫内传播或产道沾染的途径感染胎儿，大多数婴儿感染 HCMV 后无明显症状，但在少数或有免疫抑制的个体可引起严重疾病。本研究中在 HCMV 活动性感染孕妇中，其宫内感染率明显高于非感染者(P0.005)，提示孕期 HCMV 活动性感染与宫内感染有显着性关联，这支持婴儿HCMV 感染
12、主要由母亲传播而来的观点。孕妇 HCMV 感染因地理环境及不同经济阶层差异较大。秦巴山区为贫困山区，同时也是弱智高发区，该地区家庭年收入低，家庭生活环境及自我保健意识均较差，这也是影响该地区儿童智力发育低下的重要因素4。孕期 HCMV 宫内感染对胎儿产生的影响目前已经被广泛证实，但迄今为止对于孕期 HCMV 宫内感染的机制仍不是很清楚。孕期 HCMV 感染后，病毒在体内的活动状态对胎儿的影响差别较大。大部分孕妇感染 HCMV 后可呈现潜伏性感染，即病毒的非复制性感染，其对胎儿的影响很小，一般不发生先天性感染；而活动性感染对胎儿造成的危害较大，其宫内垂直传播率较高5。本研究结果也支持这一理论。由
13、此可见，HCMV 宫内感染与病毒在体内的活动状态有关。HCMV 病毒株的基因结构存在变异，其临床分离株有明显的片断长度多态性(RFLP)差异6。研究发现 HCMV UL54 基因(DNA 聚合酶基因)及 U97 基因在病毒复制过程中起重要作用78 ；进一步研究发现，HCMV UL54、U97 基因突变株不但表现出对药物(GCV)的耐药性，同时突变病毒株在组织培养实验中比标准株复制更快，在组织中更易释放910 。由此推断感染不同病毒株时病毒在体内得活动状态存在差异。那么究竟是何种原因导致 HCMV 宫内感染的发生，HCMV 在体内的活动状态是否与基因结构改变导致致病力改变有关，目前国内外尚无相关
14、报道。本课题既往研究提示该地区孕妇 HCMV 宫内感染与多种免疫因素有关11。本研究在此基础上首次采用分子生物学方法对该地区孕期 HCMV 宫内感染进行分子水平的探讨。PCRRFLP 分析结果显示，孕期 HCMV 宫内活动性感染者中未发现 UL54 501 密码子及 UL97 594 和 595 密码子的突变，但不排除其它位点的突变的可能。本次研究由于该地区样品采集条件受限，例数较少，仅进行了 UL54 和 UL97 基因 3 个密码子突变的检测，不能排除其它形式的基因异常导致病毒致病性改变存在的可能性。近年来有报道 HCMV 宫内感染与多种基因分子水平的改变有关系，可能为多种基因协同作用的结
15、果1213 。今后可在此研究的基础上，开展更深层次的研究，以揭示 HCMV 宫内感染的发生机制，最终达到提高秦巴山区出生人口素质的目的。【参考文献】1李芬，闫凤亭，韩蓁，等. 秦巴山区孕期巨细胞病毒感染状况分析 J. 中国公共卫生，2003,19(5):528529.2袁中群，杜风泽，李玲霜. 育龄妇女巨细胞病毒感染优生管理措施的研究 J. 中国优生与遗传杂志, 2004, 12(3):115116.3周萍，姚笠，王淑芬. 产妇及其新生儿人巨细胞病毒感染状况研究 J. 哈尔滨医科大学学报, 2004, 38(4):393395.4李瑞林,张富昌,黄绍平,等. 秦巴山区家庭状况对儿童智力发育的影
16、响 J. 西安交通大学学报(医学版), 2004, 25(5):507509.5岳希全，孙亚臣，石宏. 巨细胞病毒感染对孕妇及胎儿影响的研究 J. 中国实验诊断学, 2005, 9(3):340343.6Dulcineia Martins de Albuquerque, Sandra Cecllia Botelho Costa. Genotyping of human cytomegalovirus using nonradioactive single strand conformation polymorphism (SSCP) analysis J. J Virol Methods, 2003,
