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1、凝胶成像及 Quantity One 中文操作说明第一章 简介凝胶电泳是每个做分子生物学的研究者天天都要打交道的基本技术。电泳之后的信息处理与电泳本身同样重要。目前有大量软件可以用于分析电泳结果，要向大家介绍的是 Bio-Rad 公司的 1D 凝胶分析软件 Quantity One（Bio-Rad 还有一个做 2D 凝胶分析的软件 PDQuest） 。Quantity One 软件是常用 1D 凝胶分析软件中功能最强大 ，自动化程度最高的软件。这个软件的最新版本可以在 Bio-Rad 的网站（http:/www.bio-）免费下载，以供试用或用户升级之用。Quantity One 软件的主要功
2、能包括定量分析(Volumes Quick Guide)，电泳条带分析(Band Analysis)，差显分析(Differential Display Analysis) ，克隆计数 (Colony Counting Analysis)等，此外，还可以直接控制 Bio-Rad 公司的各类图像仪和 ExQuest 自动切胶仪，使您的凝胶分析工作变得极为轻松。Quantity One 软件拥有与 windows 操作系统下绝大多数应用软件相同的友好界面。插入密码狗，打开 Quantity One 软件，可以看到最上缘蓝色横条幅是标题栏，往下依次是菜单栏和工具栏。每个菜单的主要功能如下：File
3、图像打开、保存、引入、打印等操作 Match 分子量估算、条带匹配分析Edit 图像普通编辑操作 Volumn 定量分析View 图像缩放、三维视图、看光密度值等操作 Analysis 浓度估算、克隆计数等分析Image 图像旋转、翻转、裁切等操作 Reports 分析结果输出Lane 泳道分析 Window 窗口分析Band 条带分析 Help 帮助、快捷菜单、软件注册等 往下一行是工具栏，上面每个按钮的功能见下表：打开文件 图像显示控制 条带分析工具保存操作 显示条带 匹配工具打印图像 去除分析标记 轮廓修改工具看全图 图像工具 打印快捷指南局部放大 文字工具 定量分析快捷指南拖曳 定量工
4、具 条带分析快捷指南放大并居中 灰度分析工具 克隆计数快捷指南缩小并居中 泳道分析工具Quantity One 软件 HelpQuick Guide 快捷指南提示如何实现一个功能，如定量分析(Volumes Quick Guide)，电泳条带分析(Band Analysis)，差显分析 (Differential Display Analysis)，克隆计数(Colony Counting Analysis)等。快捷指南下有 1， 2，3步骤，根据提示完成。使用 Quantity One 软件进行电泳结果分析，通常包括图像获取、图像预处理、分析、结果输出四部分。图像获取就是通过软件控制扫描仪（
5、GS-800、PharosFX 等）或凝胶成像系统（GelDoc、ChemiDoc 、VersaDoc 等） ，图像预处理就是将扫描或拍照获得的原始图像进行初步处理，以便更好地进行后续分析。接下来是分析过程，根据分析的方法和目的不同，又可以分为定量分析、条带分析、克隆计数、差异（聚类）分析等等。不管如何分析，最终我们都必须通过软件的输出功能，得到我们想要的结果。Quantity One 软件提供了多种结果输出方式。在接下来的几章里，我们将按照这个思路，一步步引导您使用这一软件。第二章 图像获取Quantity One 4.44.6 版本可以控制 Bio-Rad 目前几乎所有的图像仪，如 Gel
6、Doc XR、ChemiDoc XRS 等。这些图像仪采集到的图像，可以直接保存成软件可直接分析的图像，即扩展名 1sc 的原始图像文件。下面将具体介绍如何通过 Quantity One 软件从 GelDoc XR 获取图像。GelDoc XR 是 Bio-Rad 凝胶成像系统中最常用，操作最简便的仪器，它可以用来拍摄EB、SYBR Green 等染料染的核酸电泳凝胶； Sypro Ruby、银染、考马斯亮蓝等方法染的蛋白电泳凝胶；以及化学显色的印记膜等。使用 GelDoc XR 之前，先接通电源，打开位于仪器背面右下角的电源开关；然后根据具体的应用选择合适的照明和滤光片位置。原则如下：表格形
7、式模式 1. 如果样品是通过 EB、SYBR Green、Sypro Ruby 等染料通过紫外激发来显色，就先将样品置于紫外透射平台(UV Transilluminator)的中间，关上暗箱门，然后按下面板上的“Trans UV”按钮，并将滤光片选择杆置于位置“I”处。模式 2. 如果样品是通过金属银、考马斯亮蓝等染料染色，就先将白光转换屏 (White Light Conversion Screen)取下，打开下部的开关，放在紫外透射平台上，样品置于白光转换屏中间。关上暗箱门，然后按下面板上的“Trans White”按钮，并将滤光片选择杆置于位置“I ”处。模式 3. 如果是化学显色等非透
8、明可见样品，则用模式 2 中所示方法，将样品置于白光转换屏中间。关上暗箱门，然后按下面板上的“Epi White 按钮” ，并将滤光片选择杆置于位置“O”处。接下来打开 Quantity One 软件，选择 FileGelDoc XR，按以下顺序操作： 按下 Live/Focus，成像仪进入实时成像； 选择照明模式，一般核酸胶用 UV,蛋白胶用 White 模式 注意，选择完成后，要按下成像仪面板上相应的光源按钮 此功能有三个上下键按钮：IRIS（光圈） ，ZOOM（缩放） ，FOCUS（聚焦） ，您可在软件上直接调节或在仪器面板上手工调节 调节步骤：a 调大 IRIS，以看到图像 b 点 Z
9、OOM,将胶适当放大 c 调节 IRIS 至合适大小（一般情况下尽量选择小光圈，因为小光圈景深大，图像更清晰) d 调节 FOCUS，至图像最清晰按 按“Auto Expose” ；如是，单击 Auto Expose,系统将自动选择曝光时间成像，如不满意，单击 Manual Expose，并输入曝光时间（秒） ，图像满意后保存,在自动曝光期间，图象会持续的输入到 CCD 中，直到达到一定比例的饱和象素值， 此比例在 Options dialog box 中设定 (默认值 = 0.15)。 一旦图象质量达到要求，点击 Freeze button 来终止曝光。 如是蛋白凝胶，接第 6 步直接将清晰
10、的图像保存即可 按下“Analyze” ；这将会打开一个新的窗口来显示捕获的图象，该图象具有默认名称，具有日期、时间及用户名（如果已知的话）等信息。 按下“Save”键，保存图像。第三章 图像分析Quantity One 的图像分析功能相当强大，根据不同的需要，可以分为定量分析、条带分析、相似性分析以及克隆计数(用于蓝白斑筛选 )等等，而且每种分析法都有独特的优点和输出方式。本章重点介绍常用的定量分析和条带分析方法，其余更细更深的功能请参考软件自带的用户手册。一 定量分析（Volumn Analysis）定量分析是计算选定区域内信号强度的总和，是 Quantity One 最方便的定量工具。这
11、种分析方式考虑选定区域的真实形状，可用于电泳条带、斑点、大型芯片等图像的定量。这种定量的方法可以扣除背景，可以按照用户的标准曲线计算出条带或斑点的浓度，但它不能计算分子量，也不能进行条带匹配和相似性分析。Quantity One 软件称这类定量的结果为 Volume。Volume选定区域内所有像素信号强度的总和像素面积Volume 的单位：intmm 2快捷指南 Volumes Quick Guide，能够指导您对任意所选区域进行定量分析,此分析可以报告多种结果，常用的结果是相对浓度和绝对浓度（须提供标准品） 。具体的操作方法如下：1 选择成像系统或打开已保存的文件(软件可以控制 Bio-Ra
12、d 所有的成像系统如GelDoc,ChemiDoc,VersaDoc,GS-800,FX,如不是 Bio-Rad 成像系统所摄取的图象，将图象保存为Tiff 1文件格式，软件也可进行分析处理)2 Zoom Box，缩放，对图象进行放大观察3 Transform 转化，调节图象的对比度黑白4 选择待分析区域：Volumn Contour Tool 等高线勾勒区域，自动连接浓度相同的点，如 U1 Volume Free hand Tool 自由画笔选择区域，可以勾勒出无规则形状,如 U2Volume Rect Tool 矩形区域选择，如 U3Volumn Circle Tool 圆形选择区域，如
13、U4按上面 4 种方法选择需要定量的区域。5双击所选区域，出现如下窗口，定义样品类型，如未知样品 Unkonwn(U1,U2即待计算样品) ，背景 Background(B1,B2，软件在算浓度时会将此区域的浓度自动扣除 ) 或标准样品1 必须是 8 位（bit）或 16 位（bit）无压缩的 tiff 文件Standard（Std1,Std2, 如果该样品是浓度标准样品，即定量标准，需在浓度 concentration 一栏输入该样品的浓度） 。6 Select Tool 选择不同区域7 Print Image 打印图像8 Volume Analysis Report 定量报告结果，打开出现
14、如下窗口，选择要报告的参数，主要有 2个参数 Volume、adj. Vol. (即 adjusted volume) 和 Concentration。Volume 为定量值，adj. Vol. 为扣除背景后的定量值，如有浓度标准样品（Std） ，软件可报告 Concentration 绝对浓度。参数选好后，按下按钮“done” 。9软件报告如下图所示：按右侧输出按钮，可将表格保存成 txt 文件，按左侧打印按钮，可将报告打印出来。二条带分析（Band Analysis）条带分析是 Quantity One 最基本的分析工具，它可以自动识别电泳泳道和识别条带，依据泳道的平均光密度和条带宽度对每
15、个条带进行模式化定量。这种分析方式虽然不如定量分析来得方便，但这样可以实现非常复杂的电泳分析，满足各种不同的结果需要。这种方式的最大优点在于它可以完全抛弃人为主观因素而进行全自动定量。打印 文本输出用条带分析的方法进行定量的结果叫 Trace Quantity（Trace Qty） ，计算方法是：首先软件自动计算条带上每一横排像素的平均光密度和平均光密度分布曲线，然后每个具体条带的定量值是平均光密度曲线的线下面积的积分，即：Trace Quantity平均光密度 条带上下边界的距离Trace Quantity 的单位：OD*mm条带分析中的条带定量模型下面介绍用此功能对泳道内的所有条带进行分子
16、量确定，相对浓度分析1 打开已保存的文件(如不是 Bio-Rad 成像系统所摄取的图象，将图象保存为 Tiff 2文件格式，软件也可进行分析处理)2 必须是 8 位（bit）或 16 位（bit）无压缩的 tiff 文件2 Zoom Box，缩放，对图象进行放大观察3 Transform 转化，调节图象的对比度黑白4 确定泳道(lane),并对泳道进行各种调整（实际实验中泳道往往不是垂直的而出现各种变形） 。按下图所示在软件的工具栏中有一 Lane Tool 图标，包含有更多泳道编辑工具。5选择 Frame Lanes，输入图像实际泳道(lane)数并确认。此时图像上泳道的位置上会出现一条条红线，每条红线就代表一根泳道。6选择 Add/Adjust Anchors，此时泳道红线上会出现一些小圆圈。这些小圆圈称为锚定点(anchor)，锚定点规定了泳道走向。当泳道
