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1、本实验室Elisa所需试剂器材1.试剂(1)包被缓冲液 碳酸盐缓冲液(PH9.6 0.05M)：Na2CO3 1.59gNaHCO3 2.93g加蒸馏水至1000ml作用：稀释抗原（菌悬浮液）(2)洗涤缓冲液PBST (PH7.4 0.15M)：KH2PO4 0.2gNa2HPO412H2O2.9gNaCl8.0gKCl0.2gTween-200.050.5ml加蒸馏水至1000ml作用：洗涤(3)缓冲液PBS (PH7.4 0.15M)：KH2PO4 0.2gNa2HPO412H2O2.9gNaCl8.0gKCl0.2g加蒸馏水至1000ml作用：制备封闭液(4)封闭液：牛血清白蛋白(BSA
2、) 0.1g，加缓冲液（PBS）至100ml 或PBS加2BSA作用：封闭空隙(5) 稀释液： PBST加1牛血清白蛋白(BSA)作用：稀释抗体及酶标抗体(5)HRP羊抗兔IgG一酶标抗体 作用：结合抗体(6)底物缓冲液 磷酸盐柠檬酸(PH5.5):0.2M Na2HPO4(28.4g/L) 25.7ml0.1M 柠檬酸(19.2g/L) 24.3ml蒸馏水50ml作用：制备TMB(7)TMB(四甲基联苯胺)使用液:TMB(10mg/5ml无水乙醇) 0.5ml底物缓冲液(PH5.5) 10ml0.75H2O2 32l 作用：显色(8)终止液(2MH2SO4）：蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓
3、硫酸(98)21.7ml作用：终止反应2.器材:聚苯乙烯塑料板(酶标板)96孔抗原制备：以平板划线法将供试菌菌接种于普通营养琼琼脂培养基上，28 培养24 h 后，挑取单菌落接种于LB液体培养基中，过夜培养； 5 000 rmin-1离心10 min，弃上清；加入1%的甲醛于37 灭活24 h，通过菌落涂布法检测灭活效果； 5 000 rmin-1离心10 min，弃上清，用麦氏比浊法，配制出浓度约为1109 cellsmL-1的菌悬液作为免疫抗原。抗血清制备：抗血清不能直接用于包被，应先提取IgG。大量工作表明，只用硫酸铵沉淀就可以得到足够纯度及高活性的IgG蛋白。其基本步骤如下：(1)取抗
4、血清0.2 ml；(2)加生理盐水（0.85 NaCl）0.3 ml，混匀；(3)逐滴加入饱和 (NH4)2SO4 0.5 ml，充分振荡混匀，4静置1 h；(4)10000 rpm/min离心20 min，弃上清；(5)加0.5 ml生理盐水重悬浮，混匀；(6) 0.25 ml饱和 (NH4)2SO4，充分振荡混匀，4静置1 h；(7)10000 rpm/min离心20 min，弃上清；(8) 重复58步骤一次；(9)加生理盐水0.5 ml重悬浮，混匀；(10)生理盐水中透析1224 h；(11)在0.2 M pH 9.0硼酸缓冲液透析1224 h；(12)分装，即将使用时4保存，备用-20
5、保存。为最大限度保持抗体活性，整个过程应在4下进行。对于冻干抗血清或长时间保存的血清，将生理盐水透析改为3 M KCNS透析，促使聚合的多聚体解聚。硫酸铵法纯化血清IgG 粗品: 取1份血清加入1份生理盐水进行稀释, 边搅拌边加入2倍原血清体积的饱合硫酸铵, 室温放置30min, 7 000r / min离心30min; 沉淀溶于原血清体积的生理盐水中, 加入1倍体积的饱合硫酸铵, 室温放置30min, 重复第二步, 将沉淀溶于1/ 10原血清体积的生理盐水溶液中, 在0. 0175 mol/ L pH6. 3 PB 缓冲液中透析至无NH4+为止。免疫血清效价的测定：采用试管凝集法测定抗血清的
6、效价。ELISA检测流程：用pH 9.6的0.05 mol/L 碳酸盐缓冲液稀释抗原，加入96孔聚苯乙烯酶标反应板孔内，每孔100 L，60 烘干，用PBST缓冲液（注满孔）洗涤3次；每孔加入300 L 2BSA -PBST封闭液，37 封闭1 h，PBST缓冲液洗涤3次；每孔加入100 L 适当稀释的阳性血清和阴性血清，37 反应1 h，PBST缓冲液洗涤3次；每孔加入100 L的羊抗兔IgG-HRP酶标抗体，37 反应1h； PBST缓冲液洗涤3次；加新配制的TMB-H2O2底物溶液（临用15分钟内），每孔100 L，37 避光反应20min；以50 L 2 molL-1 H2SO4终止反
7、应；15分钟内用酶标检测仪读取OD450值，以判定结果。抗原最佳包被浓度和免疫血清最适稀释度的确定：棋盘法：将1x109CFUmL的菌体悬液梯度稀释至lxl05CFUmL，使抗血清做1:2000、1：5000、110 000、115 000、120 000稀释。酶标抗体做1：1000稀释，每个稀释度包被3个孔，进行间接ELISA测定。以能产生OD450值为1.0左右，且PN值最大的为抗原抗体最佳稀释度。酶标二抗最适稀释倍数确定：在确定的抗原抗体最佳工作浓度下，将酶标二抗稀释为1：l000、l：2000、l：5000、l：10000、1：20000 5个稀释比试验，依据其OD450值在1.0左右
8、的选择为最佳二抗稀释比，且PN值最大为最佳稀释度。硼酸缓冲液一般PH6.779.24A液：0.2mol/L硼酸 0.05mol/L NaCl配方：硼酸:1.2368g，NaCl 0.2925g, 加蒸馏水至100mlB液：0.05mol/L硼酸钠配方：硼酸钠1.907g,加蒸馏水至100ml不同的PH值配方如下：PH A(ml) B(ml) PH A(ml) B(ml) 6.77 9.7 0.3 8.41 5.5 4.57.09 9.4 0.6 8.51 5.0 5.57.36 9.0 1.0 8.60 4.5 6.07.60 8.5 1.5 8.69 4.0 6.07.78 8.0 2.0
9、8.84 3.0 7.07.94 7.5 2.5 8.98 2.0 8.08.08 7.0 3.0 9.11 1.0 9.08.20 6.5 3.5 9.24 0 10. 08.31 6.0 4.0透析袋使用前处理： 1. 把透析袋剪成适当长度（10-20cm）的小段。 2. 在大体积的2%(W/V)碳酸氢钠和 1mmol/L EDTA(pH 8.0)中将透析袋煮沸10分钟。 3. 用蒸馏水彻底清洗透析袋。 4. 放在 1mmol/L EDTA(pH 8.0)中将之煮沸10分钟。 5. 冷却后，存放于4度，必须确保透析袋始终浸没在溶液内。从此时起取用透析袋是必须戴手套。 6. 用前在透析袋内装
10、满水然后排出，将之清洗干净。透析膜 (前处理方法如下)：1. 戴手套把透析膜剪成适当长度，浸在蒸馏水中 15 min 泡软。 2. 浸入 10 mM 碳酸氢钠中，并加热至 80，一边搅拌至少 30 min。 3. 换到 10 mM Na2EDTA 中浸泡 30 min，以新鲜的 EDTA 同样方法处理三次。 4. 再用 80 蒸馏水洗 30 min，然后换到 20% 酒精中，放在 4 冰箱中保存。方法一：1、 把透析袋剪成适当长度（10-20cm）的小段。2、 在大体积（500mL）的2%（W/V）的碳酸氢钠和1mmol/L EDTA.2Na (pH=8.0)中将透析袋煮沸10min。3、 用
11、蒸馏水彻底清洗透析袋。4、 放在500mL的1 mmol/L EDTA.2Na (pH=8.0)中将之煮沸10min。5、 冷却后，置于30或者50%的酒精中，放于4冰箱，必须确保透析袋始终浸没在溶液内。从此时起取用透析袋必须戴手套。6、 在使用前要用蒸馏水将透析袋里外加以清洗干净。说明：透析液的配置：10g NaHCO3 + 186.6mg EDTA.2Na + 500mL蒸馏水1 mmol/L EDTA.2Na：即373.2mg/L方法二：可用沸水煮5至10分钟，再用蒸馏水洗净，即可使用。方法三：可先用50乙醇煮沸1小时，再依次用50乙醇、0.01 mol/L碳酸氢钠和1 mmol/L E
12、DTA（pH=8.0）溶液洗涤，最后用蒸馏水冲洗即可使用。说明：1.EDTA煮主要是为了除去生产时附着在透析袋上的金属离子。2.透析袋的截留分子量3000kd。使用后的透析袋保存方法：1.用生理盐水浸泡以去掉蛋白，并用蒸馏水清洗干净，然后置于50乙醇中保存即可；2.用完以后,要彻底洗干净,透析袋也可以保存在0.1%叠氮钠（可防止微生物生长）里；0.05%-0.1%叠氮钠，或者1mM EDTA，或者50甘油中4度保存，公司的人建议前两种保存比较好！3.使用后的透析袋洗净后可存于4蒸馏水或者30%乙醇中，确保透析袋始终浸没在溶液内。若长时间不用，可加少量NaN2，以防长菌。从此时起取用透析袋必须戴
13、手套。洗净凉干的透析袋弯折时易裂口，用时必须仔细检查，不漏时方可重复使用。实验操作： 1、取空白酶标板，于每孔中加入纯化蛋白溶液100L ，于振荡器上震荡混匀，用封口膜封盖酶标板，室温包被过夜。2、取下封口膜，弃去酶标板内溶液，用洗剂液（1PBST）洗剂酶标板5次，最后一次吸干。每孔加入1%BSA封闭液100L， 37封闭1h。3、取下封口膜，弃去酶标板内溶液，用洗剂液（1PBST）洗剂酶标板5次，最后一次吸干。每孔加入一抗血清100L，37封闭1h。4、取下封口膜，弃去酶标板内溶液，用洗剂液（1PBST）洗剂酶标板5次，最后一次吸干。每孔加入酶标二抗兔抗羊IgG-HRP 100L，37封闭1h。5、取下封口膜，弃去酶标板内溶液，用洗剂液（1PBST）洗剂酶标板5次，最后一次吸干。每孔加底物A 50L和底物B 50L，震荡混匀，室温显色1015min。6、 每孔加入终止液50L，立刻在酶标仪450nm波长下读取OD值。加样孔 OD值检测血清其他血清 阴性血清或未免血清（只加稀释液或未免血清、酶标二抗，底物显色液A、B及终止液）酶空白孔 （只加酶标二抗，底物显色液A、B及终止液）底物空白孔 （只加底物显色液A、B及终止液）纯空白孔 （只加终止液）抗血清的纯化 (Purification of antiserum) 抗血清纯化的目的是尽量除去抗血清中与目的抗体不相关的成分
