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1、药学论文-RPHPLC 法测定脑得生片中羟基红花黄色素 A 的含量【摘要】 目的 采用反相高效液相色谱法建立了测定脑得生片中羟基红花黄色素 A 含量的方法。方法 采用超声波法提取，经大孔树脂 HP20 纯化后，以反相高效液相色谱法测定羟基红花黄色素 A 的含量。色谱柱为 Phenomenex Luna C18（5 m，3.9 mm150 mm），流动相为甲醇 乙腈0.7% 磷酸溶液(体积比21574)，流速 1 .0 mLmin-1，柱温 30 ，检测波长 403 nm。结果 羟基红花黄色素 A 在 1.229.15 g/mL 范围内线性关系良好，相关系数为0.9998。平均加样回收率为 10
2、0.93%，RSD 为 1.73%。结论 该方法准确、专属性强、重复性好，可用于测定脑得生片中羟基红花黄色素 A 的含量。 【关键词】 脑得生片 羟基红花黄色素 A 含量测定 大孔树脂脑得生片由三七、川芎、红花、葛根和山楂等组成，具有活血化瘀、疏通经络、醒脑开窍之功效1。2005 年版中国药典仅以三七皂苷为定量指标对脑得生片进行质量控制1。而红花作为该药的重要组成部分之一，其主要有效成分羟基红花黄色素 A (hydroxyl safflor yellow A, HSYA)具有扩张冠状动脉、缓解心肌缺血和抗凝血、抑制血栓形成等作用2, 3，在脑得生片治疗脑血管疾病方面起重要作用。目前，关于脑得生
3、片中红花成分的质量控制方法研究尚未见报道。本文建立了测定脑得生片中 HSYA 含量的 RPHPLC 法，为进一步有效控制脑得生片的质量提供了实验依据。1 仪器与试药11 仪器Waters 2695 型高效液相色谱仪；Waters 2996 二极管阵列检测器；Waters Empower 色谱工作站；KQ100 超声波清洗器(100 W，昆山市超声仪器有限公司)；RE52CS 旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。12 试药甲醇和乙腈为色谱纯，屈臣氏双蒸水，其它试剂均分析纯； HP20 型大孔树脂（Diaion，日本三菱化学公司）；羟基红花黄色素 A（批号：111637-200502 中国药品生物制
4、品检定所）；脑得生片（规格：3 g/片，批号分别为：20070302、20070312、20070322，广东药学院中药学院）。2 方法与结果21 色谱条件与系统适用性试验Phenomenex Luna C18 (5 m，3.9 mm150 mm)色谱柱；流动相为甲醇乙腈0.7% 磷酸(体积比 21574)；检测波长为 403 nm；流速为 1.0 mLmin-1；柱温为 30 。理论塔板数以羟基红花黄色素 A 计算不低于 3 000；分离度大于 1.5；重复性 RSD 为 1.58%；羟基红花黄色素 A 峰的拖尾因子为 1.03。色谱图见图 1。图 1 羟基红花黄色素 A 对照品（A），阴性
5、对照（B），供试样品(C)色谱图（略）Fig.1 HPLC chromatograms of reference substance(A), negative reference substance HSYA (B) and sample（C）2.2 溶液的制备22.1 对照品溶液的配制取羟基红花黄色素 A 对照品 1.0 mg，精密称定，置 10 mL 容量瓶中，加入30%（体积分数）甲醇 5 mL，超声溶解后，用 30%（体积分数）甲醇定容至刻度。精密移取 5.0 mL，加 30%（体积分数）甲醇稀释至 10.0 mL，揺匀，制得质量浓度为 0.061 mgmL-1 的对照品溶液，密封保存
6、，备用。22.2 供试品溶液的制备取脑得生片 20 片，去糖衣，研细。取 1.0 g，精密称定置具塞锥形瓶中，加入 30%（体积分数）乙醇 50 mL，超声提取 30 min，滤过，滤液于 50 下减压回收至无醇味，然后加纯净水 20 mL 分散，水分散液过 HP20 型大孔树脂柱(内径 1.5 cm，长 10 cm)，以 50 mL 水洗脱，弃去水液。再用 30%（体积分数）乙醇洗脱，收集 50 mL，旋蒸仪浓缩至干，加 30%（体积分数）甲醇溶解转移至25 mL 容量瓶中，用 30%（体积分数）甲醇定容至刻度，揺匀，即得。2.2.3 阴性对照溶液的制备按脑得生片处方比例制成不含红花的阴性对
7、照样品，依“2.2.2”项方法制得阴性对照溶液。23 阴性对照试验分别取供试品溶液，阴性对照溶液及对照品溶液，以 10 L 进样量，在色谱条件下进行测定，结果表明，阴性无干扰，见图 1。24 线性范围精密吸取“2.2.1”项对照品溶液 0.20 mL，0.40 mL，0.60 mL，0.80 mL，1.00 mL，1.50 mL，置 10 mL 容量瓶中，以 30%（体积分数）甲醇稀释至刻度，摇匀，制得系列浓度对照品溶液。 分别进样 10 L，按“2.1”项下色谱条件测定 HSYA 的峰面积，以对照品质量浓度（）为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，计算回归方程为：A=5.07409105-3.28
8、29104，r=0.9998，结果表明 HSYA 在 1.229.15 g/mL 范围内与峰面积具有良好的线性关系。25 精密度试验分别精密吸取同一批 HSYA 对照品溶液 10 L，按“2.1”项下色谱条件进样，平行测定 6 次，测得平均峰面积为 3 087 600，RSD 为 2.16%。26 稳定性试验取同一供试品溶液(批号为 070302)，每 2 h 进样 1 次，体积均为 10 L，按“2.1”项下色谱条件测定 6 次，测得样品中 HSYA 的平均质量浓度为 0.0427 mgmL-1，RSD%为 0.87%。结果表明，供试品溶液在 10 h 内稳定。27 重复性试验取同一批号样品
9、(批号为 070302)，6 份各约 1 g，精密称定，按“2.2.2”项制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件测定。测得样品中 HSYA 的平均含量为 1.0569 mgg-1，RSD 为 1.29%。结果表明，样品重复性良好。28 加样回收率试验取 6 份已知含量的供试品 1 g，精密称量，置于具塞锥形瓶中，分别加入浓度为 0.059 mg/mL 的 HSYA 对照品溶液 10 mL，照“2.2.2”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件测定，计算 HSYA 的回收率，结果平均回收率为100.93%，RSD 为 1.73%。29 样品含量测定取 3 批样品（批号 20070302、2
10、0070312、20070322），按“2.2.2”项方法制备供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 10 L，在色谱条件进行测定，采用外标一点法计算样品中羟基红花黄色素 A 的含量。3 批样品的测定结果分别为 0.317 1、0.326 4、0.316 2 mg/片。3 讨论31 HSYA 提取方法的优选4：曾分别采用水、30（体积分数）乙醇、60（体积分数）乙醇等为溶媒，以超声、回流和浸渍等方法对样品进行提取，以 HSYA 的提取率为指标，选择最佳提取方法。结果表明，样品以30（体积分数）乙醇为溶剂超声 30 min 的提取液中 HSYA 的含量最高，确定以此作为样品的提取方法。
11、3.2 采用大孔树脂纯化脑得生片中的有效部位 HSYA 5，并结合高效液相色谱法测定其含量，检测波长为 403 nm 时，阴性无干扰，专属性强。结果表明，该提取纯化方法切实可行，色谱条件简单，结果准确，重现性好，可有效控制该制剂的质量。【参考文献】1 国家药典委员会. 中华人民共和国药典：2005 年版一部S. 北京：化学工业出版社，2005：572.2 李中原，涂秀华. 红花黄色素的药理研究进展J. 中药新药与临床药理，2006，16(2)：153-156.3 杨玉霞, 吴卫, 郑有良. 红花研究进展J. 四川农业大学学报，2004，22(4):365-368.4 周平兰，夏新华. 红花黄色素提取工艺的研究J. 湖南中医学院学报，2004，24(1)：11-12.5 宋洪涛，初 阳，张倩，等. 大孔吸附树脂纯化红花提取物的研究J. 中草药，2006，37(7)：996-1000.
