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1、第三章 培养基制备,知识目标 1.掌握培养基的常见原材料； 2.掌握淀粉水解糖的制备方法； 3.掌握培养基的灭菌方法。 能力目标 1.能够根据生产要求选择合适培养基； 2.在生产中，能根据企业现状选择合适的培养基灭菌方法。,第一节工业发酵培养基,一、培养基的营养成分及用途 光 光能自养 自养菌 氢、硫、氨 化能自养 1.能源 亚硝酸盐、亚铁盐 碳水化合物等有机物 石油天然气和石油化工产品（如醋酸）异养菌 功能：生长、繁殖需要,碳酸盐 2.碳源 淀粉水解糖、糖蜜、亚硫酸盐纸浆废液等 石油、正构石蜡、天然气 醋酸、甲醇、乙醇等石油化工产品 功能：提供能量、构成菌体、代谢产物的物质基础,有机氮：黄豆
2、饼粉、花生饼粉、玉米浆、蛋白胨、 3.氮源 酵母粉、鱼粉、发酵菌丝体、酒糟水等 无机氮： 尿素、硫酸铵、氨水、硝酸盐 功能：构成菌体、含氮代谢物；,磷酸盐、钾盐、钙盐等矿物盐 4.无机盐 铁、锰、钴等微量元素 功能：构成菌体，参与酶的组成，维持酶活性，调节渗透 压，调节pH值，维持氧化还原电位； 5.生长因子 硫胺素、生物素、对氨基苯甲酸、肌醇等 功能：酶的辅助部分,6前体、促进剂与抑制剂 发酵培养基中某些成分的加入有利于调节产物的形成，而并不促进微生物的生长，这些物质包括前体、促进剂和抑制剂。,（1）前体 指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，而其
3、自身的结构没有多大的变化，但产物的产量却因加入前体而有较大的提高。 如：在青霉素生产中加入玉米浆，青霉素产量可从20u/mL增加到100u/mL，研究发现玉米浆中的苯乙胺被有限结合到青霉素分子中，从而提高了青霉素G的产量。,（2）促进剂 指那些既不是营养物又不是前体，但却能提高产量的添加剂。 比如在酶制剂发酵过程中，加入诱导物、表面活性剂及其它一些产酶促进剂（比如吐温80、植酸、洗衣粉等）,（3）抑制剂 在发酵过程中加入抑制剂会抑制某些代谢途径的进行，同时会使另外一些代谢途径活跃，从而获得人们所需要的某种产物。 例如：微生物发酵生产甘油中，例如亚硫酸氢钠，它与代谢过程中的乙醛生成加成物。,-磷
4、酸甘油的合成,糖原1-P-葡萄糖6-P葡萄糖EMP途径6-P-果糖 磷酸酶 -磷酸甘油脱氢酶 甘油 -磷酸甘油磷酸二羟丙酮 NAD+ NADHH+ 3-磷酸甘油醛 丙酮酸羧化支路 丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸 丙氨酸,7.水分 功能：生化反应均在水溶液中进行,第二节 培养基的类型及选择,1.依营养物质的来源分类 天然培养基； 合成培养基：也称组合培养基（多用于定量研究）； 半合成培养基：（用的最多，在部分天然有机碳源、氮源、生长因子的基础上，适当加入一些化学药品）；,2.依培养基的物理状态来分： （1）固体培养基 A、凝固培养基 ：即遇热可融化，冷却后则凝固的固体培养基。 B、天然固体培养基：由天然
5、固体状基质直接制成的培养基，如麸皮，米糠，木屑等。 （2）半固体培养基 加入0.5%左右的琼脂作为凝固剂，形成的培养基称之半固体培养基。 主要用于菌种鉴定，观察细菌运动特征及噬菌体的效价测定等。 （3）液体培养基； 培养基中8090%是水。,3.依培养基的用途来分 （1）孢子培养基 （2）种子培养基 （3) 发酵培养基 （4）补料培养基 （5）加富培养基 （6）选择培养基 （7）鉴别培养基 （8）增殖和保存培养基 （9）富集培养基 （10）测定培养基,三、发酵培养基的选择,（一）、配制培养基的原则 1.根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基 2.注意各营养物质的浓度和配比 3.调节适宜的物理
6、化学条件 4.根据培养微生物的目的配制 5.尽量使用廉价易得的原料,1.查阅文献 2.借助优选法或正交试验法精心设计培养基配方 3.实验比较 实验的规模一般由定性到定量，由小到大。 发酵培养基的用途与要求、成分、配比经实验确定，配制时兼顾原料来源、成本及工艺管理；,（二）、选择培养基的方法,第三节 培养基的配制,一、培养基的配制原则 培养基的必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分； 有利于减少培养基原料的单耗，单位营养物质所合成产物数量大或产率大； 有利于提高培养基产物的浓度，以提高单位窖发酵罐的生产能力； 有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期； 尽量减少副产物的形成； 减少对发酵过程中
7、通气搅拌的影响，有利于提高氧的利用率、降低能耗； 有利于产品的分离和纯化；并尽可能减少产生“三废”的物质。,1根据微生物的培养需要。 2营养成分比例恰当 3渗透压 4pH值 5氧化还原电位 在配制培养基时，还要考虑到营养成分的加入顺序，为了避免生成沉淀而造成营养成分的损失，加入顺序一般为先加入缓冲化合物，溶解后加入主要物质，然后加入维生素，氨基酸等生长素类物质。,二、培养基成分配比的选择 培养基的组分（包括这些组分的来源和加入方法）、配比、缓冲能力、黏度、消毒是否彻底、消毒后营养破坏的程度及原料中杂质的含量都对菌体生长和产物形成有影响。,三、配置培养基的基本过程 配置培养基的基本流程如下： 原
8、料称量溶解调节pH值过滤澄清分装塞棉塞和包扎灭菌,1.原料称量、溶解 根据培养基配方，准确称取各种原料成分，在容器（常采用铝锅或不锈钢锅）中先加所需水量的一半，然后依次将各种原料加入水中，用玻璃棒搅拌使之融化，某些不易溶解的原料如蛋白胨、牛肉膏等可事先在小容器中加水少许并加热溶解后再冲入容器中，有些原料需用量很小，不易称量，可先配成高浓度的溶液，在按比例换算后取一定体积的溶液加入容器中。 2.酸碱度（pH值）的调整 常用盐酸及氢氧化钠溶液进行调节。 3.培养基的过滤和澄清 培养基过滤和澄清的方法，有以下几种： 纱布过滤；棉花过滤；保温过滤,4.培养基的分装 培养基中如有某些不溶于水的原料（如碳
9、酸钙），应在分装前不断搅拌，使成悬浮状态，才能均匀的分装到各容器内。 培养基的分装量，必须依照使用目的及试验的具体情况决定。 5.塞棉塞和包扎 加棉塞的作用主要在于阻止外界微生物进入培养基内，防止由此可能导致的污染，同时还可保证良好的通气性能，使微生物能不断的花获得无菌空气。,6.培养基灭菌 一般情况下，经分装、塞棉塞、包扎后，应立即进行灭菌 灭菌后，需做斜面的试管，应趁热及时摆成斜面，斜面也可在特制的斜面架上摆放，斜面的斜度要适当，使斜面的长度约为管长的1/3。 7.培养基的贮存 对含有染料或其它对光敏感物质的培养基，要特别注意避光保存，特别是要避免阳光的长时间直接照射。,四、固体曲料的配制
10、,直接用固体原料加水拌成的固体培养基叫做曲料。 1.曲料的组成原料 2.曲料的加水量 一般情况下，可掌握加水量在1:11:1.5倍于原料重量。检验标志是：加水后用手攥起来，稍用力挤握，指缝间有水珠溢出而不滴下为度。 3.曲料酸碱度的调整,第四节 淀粉水解糖的制备,淀粉水解糖的制备方法 1.酸解法： 定义：以酸（无机酸或有机酸）为催化剂，在高温高压下将淀粉水解为葡萄糖的方法。 优点：设备要求简单，水解时间短（20min），设备生产能力大。 缺点：高温高压下进行，设备要求耐腐蚀、耐高温、耐高压，副反应多，对原料要求严格，淀粉颗粒不宜过大，淀粉乳浓度不能过高。,2.酶解法：（双酶水解法） 定义：用淀
11、粉酶将淀粉水解为葡萄糖的过程。一般分为两步：第一步是利用淀粉酶将淀粉液化转为糊精及低聚糖，使淀粉的可溶性增加，这个过程称为液化。第二步是利用糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解，转变为葡萄糖的过程，称为糖化。也称双酶法。,-淀粉酶（液化） 葡萄糖淀粉酶（糖化） 优点：（1）反应条件温和。 （2）酶的专一性强，副反应少。 （3）可在较高的淀粉乳浓度下水解。 （4）糖液的营养物质丰富。 （5）糖液色泽浅，无苦味，有利于糖液的精制。 缺点：时间长（23）天，要求的设备多，糖液过滤困难。,1调浆配料槽； 2，8过滤器；3，9，14，17泵；4，10喷射加热器；5缓冲器；6液化层流罐；7液化液贮槽；11灭菌罐
12、；12板式换热器；13糖化罐；15压滤机；16糖化暂贮槽；18贮糖槽,双酶法制糖工艺流程图,3.酸酶结合法 酸酶法 酶酸法,淀粉制糖过程考察指标,DE值：糖化液中还原糖含量(以葡萄糖计)占干物质的百分率为DE值,第五节 培养基的灭菌,一、消毒与灭菌在发酵工业中的应用 消毒：指用物理和化学方法杀死物料、容器、器具内外的病源微生物。一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢。 灭菌：用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢。消灭杂菌和防止杂菌污染。,二、灭菌方法： 干热灭菌、湿热灭菌、物理灭菌（射线、微波等）、化学灭菌（各种化学药品）； 1.干热灭菌法 灼烧灭菌、在电热或红外
13、线在设备内加热 主要用于保持干燥的物料、器具等,2.湿热灭菌法 借助蒸汽释放的热使微生物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键，特别是氢键受到破坏，引起不可逆的变性，使微生物死亡。 优点：1）蒸汽来源容易，操作费用低廉，本身无毒 2)蒸汽具有很强的穿透力，灭菌易于彻 3）蒸汽均有很大的潜热，冷凝后的水分有利于湿热灭菌 4）蒸汽输送可借助本身的压强，调节方便，技术管理容易 缺点：1)设备费用高 2）不能用于怕受潮的物料灭菌,3.射线灭菌 紫外线 4.化学药品灭菌法 表面消毒剂 高锰酸钾溶液：0.10.25%、漂白粉 、75的酒精、新洁尔灭和杜灭芬、甲醛 37、戊二醛、过氧乙酸、焦碳酸二乙酯、酚
14、类,三、培养基的灭菌方法,（一）分批灭菌 将配制好的培养基输入发酵罐内，直接用蒸汽加热，达到灭菌要求的温度和压力后维持一定的时间，再冷却至发酵要求的温度，称为分批发酵或实罐灭菌。,1.分批灭菌的操作过程（实罐灭菌） （1）培养基的预热 培养基先加热到8090，然后再导入蒸汽升温到120180。 目的： 1）防止直接导入蒸汽时由于培养基与蒸汽的温度过大而产生大量的冷凝水使培养基稀释 。 2）防止直接导入蒸汽所造成的泡沫急剧上升而引起的物料外溢。,（2）培养基灭菌 从各路通入蒸汽（进气口、排料口、取样口），温度升到120130，保温30min,2.分批灭菌的注意事项 （1）各路蒸汽进口要畅通，防止
15、短路逆流；罐内液体翻动要剧烈，以使罐内物料达到均一的灭菌温度。 （2）排气量不宜过大，以节约蒸汽。 （3）灭菌将要结束时，应立即引入无菌空气以保持罐压，然后开夹套或蛇管冷却，以避免罐压迅速下降产生负压而吸入外界空气，或引起发酵罐破坏。 （4）在引入无菌空气前，罐内压力必须低于过滤器压力，否则培养基将倒流入过滤器。,（二）连续灭菌（连消） 培养基经过一套灭菌设备连续的加热灭菌，冷却后送入已灭菌的发酵罐内的灭菌工艺过程。又称连消。,连续灭菌流程,连消塔式连续灭菌流程 1-料液罐 2-连消泵 3-连消塔 4-维持罐 5-喷淋冷却器,喷射加热式连续灭菌流程,板式换热器式连续灭菌流程 1、2、3-板式换热器,作业： 1.微生物发酵培养基的碳源、氮源主要包括哪些物质？ 2.简述发酵工业常用的灭菌方法。 3.试画出两种不同的培养基连续灭菌流程图。,
